Jak se stanoví úroveň fosforylace?

Úroveň fosforylace organických molekul nebo látek je stanovena dvěma metodami: Western blotting a hmotnostní spektrometrie.Fosforylace nejčastěji odkazuje na připojení fosfátu k proteinu.Když se fosfáty připojují k protienům, jsou narušeny přirozené procesy a funkce proteinových enzymů v lidském těle.Stanovení úrovně fosforylace je zásadní pro léčbu širokého rozsahu onemocnění, od rakoviny po diabetes.Obvykle se používají protilátky, jako jsou monoklonální protilátky anti-fosfosspho-tyrosinu, protože se snadno vážou na proteiny tyrosinové zbytky, které jsou ovlivněny fosforylací.Při westernovém přenosu jsou proteiny nejprve odděleny velikostí pomocí metody elektrického náboje známé jako gelová elektroforéza.Jakmile jsou proteiny přeneseny, protilátky se budou držet jakýchkoli proteinů s připojeným fosfátem.Úroveň fosforylace pak může být stanovena rentgenem membrány.Jakékoli postižené proteiny vydá záblesk světla, což usnadní výzkumníkovi měření hladin fosforylace.

Hmotnostní spektrometrie je dalším způsobem, jak měřit úroveň fosforylace látky.Tento proces přeměňuje proteinové molekuly na ionty, což usnadňuje sledování a měření.Vzorek je ionizován zdrojem iontů s vysokým výkonem, který zaplavuje vzorek elektrony.Tato akce mění vzorek na kationty, pozitivně nabité ionty.

Hmotný analyzátor hmotnostního spektrometru odděluje ionty jejich hmotností a intenzitou náboje.To umožňuje výzkumníkovi objevit poměr hmotnosti k náboji, což je rozhodující při objevování úrovně fosforylace vzorku.Nakonec detektor měří ionty v pořádku, aby byla data zobrazena ve formě grafu.Graf ukazuje poměr hmotnosti k náboji iontů na ose x a relativní intenzitu iontů na ose y.

Hladiny fosforylace lze také měřit během fosforylace substrátu.Fosforylace substrátu je proces, který během glykolýzy vytváří adenosin triphosfát (ATP), molekulu kritickou pro přenos energie mezi buňkami.K tomuto procesu dochází jak v živočišných buňkách, tak v rostlinných buňkách.

V rostlinných buňkách se molekuly ATP vytvářejí pomocí energie ze slunce.Tato energie způsobuje fosforylaci v rostlinách chloroplasty, místo fotosyntézy rostlin.Úroveň fosforylace koreluje s množstvím fosfátu potřebného k vytvoření dalších molekul ATP.