Jaké jsou různé metody stanovení koncentrace proteinu?

Existují stovky různých metod stanovení koncentrace proteinu.Neuvěřitelná rozmanitost v typech proteinových roztoků, které biochemici analyzují, je důvod, proč neexistuje jediná univerzální metoda, která by fungovala pro každý typ proteinového roztoku.Nejběžnějšími proteinovými testy jsou test Bradford, test Lowry a test kyseliny bicinchoninové.Nicméně nesčetné variace byly vyvinuty podle potřeby pro řešení jakýchkoli potenciálních chemických nekompatibility mezi proteinovým roztokem a činidly, která se používají v testu.V první skupině metod se do proteinového roztoku přidá barevné nebo fluorescenční barvivo a váže se konkrétně na protein.Vázané barvivo má jedinečnou absorpční vlnovou délku, která je úměrná množství proteinu.Použitím spektrometru je možné odhadnout koncentraci proteinu.

Druhá skupina testů zahrnuje přidání iontů mědi (II) do roztoku proteinu, kde jsou tyto ionty redukovány na mědi (i) ionty.Tyto snížené ionty jsou pak schopny tvořit barevné komplexy vazbou na proteiny.Měřením absorbancí na jejich jedinečných vlnových délkách lze také odvodit koncentrace proteinů.V tomto testu se do proteinového roztoku za kyselých podmínek přidá červené barvivo zvané Coomassie brilantní modrá.Protože se toto barvivo váže na protein, tvoří permanentní modrý komplex s charakteristickou absorbancí na 595 nanometrech.Zejména Bradfordský test je narušen přítomností dodecylsulfátu sodného (SDS), detergentu, který se běžně používá k čištění proteinů a rozkládání buněk lýzou.Tento detergent interferuje s vazbou barviva na proteiny, což má za následek nespolehlivý a nepřesné absorpční čtení.Při přítomnosti SDS je tedy třeba použít jiné typy metod.V této reakci je protein kombinován s vodnou bází a ionty mědi (II).Tyto ionty jsou redukovány a poté chelátovány proteinem za vzniku barevných komplexů.Dva testy, které používají tento test, jsou test Lowry a test bicinchoninové kyseliny.Reagent Folin-Ciocalteu oxiduje aromatické zbytky, zejména tryptofan, a pomáhá komplexu silně absorbovat při 750 nanometrech.Na druhé straně test kyseliny bicinchoninové kyseliny zahrnuje přidání bicinchoninové kyseliny do testu Biuret.Po krátké inkubaci při asi 104 deg;Fahrenheit (40 deg; Celsia), dva ekvivalenty kyseliny a peptidové vazby proteinu chelátu jediné mědi (i) iontu.Výsledkem je komplex, který silně absorbuje na 562 nanometrech.Přítomnost některých postranních řetězců aminokyselin, disulfidových vazeb a kofaktorů může způsobit, že stanovení koncentrace proteinu je divoce nepřesná.Často je nutné, aby člověk zvážil nejen proteiny, ale také jiné činidla a pufry, jako je redukční činidla a detergenty.Ideální metoda bude chemicky kompatibilní a také bude spolehlivá, levná a jednoduchá nastavení.