Jaký je isoelektrický bod?

Proteiny jsou postaveny z řetězců aminokyselin, z nichž každá má různé hodnoty pH.Celkový pH proteinu je složen ze směsi hodnot pH jednotlivých aminokyselin, protože vytvářejí ionty v konkrétním roztoku, ve kterém jsou rozpuštěny.Isoelektrický bod (PI) proteinu je pH, při kterém tento protein nemá čistý náboj.Tato vlastnost může být využita k oddělení proteinu se známým PI od jiných proteinů v heterogenní směsi.

Aminokyseliny mají amino terminálovou skupinu, která je základní, má vysoké pH.Druhým koncem aminokyseliny je karboxylový terminál, který je kyselý, s nízkým pH.Při různých hodnotách pH se aminokyseliny na proteinech budou lišit v jejich náboji.Proteiny pod jejich isoelektrickým bodem mají kladný náboj.Naproti tomu nad tímto bodem mají záporný náboj.

Pro využití znalostí isoelektrického bodu pro čištění proteinu je směs proteinů podrobena elektrickému poli.To se běžně provádí v agarózových nebo polyakryladových gelech a je známé jako isoelektrické zaostření.Starší technikou je provádět postup ve větším měřítku ve skleněném sloupci pomocí roztoku sacharózy s elektrodami na každém konci.Přidávají se sloučeniny nazývané amfolyty, které způsobují tvorbu konzistentního gradientu pH.Když je gel nebo kolona podrobena elektrickému proudu, proteiny migrují, dokud nedosáhnou svého isoelektrického bodu, a poté zůstanou stacionární.

Proteiny na gelech jsou obvykle viditelné barvivem, které váže proteiny.Někdy, pokud jsou studovány enzymy, lze použít substrát, který dává barevnou reakci.Obvykle se používají standardy, které mají proteiny známých isoelektrických bodů.Protein pak může být purifikován a sekvenován.Jakmile je sekvence známa, může být použita k návrhu primerů pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a použito k klonování genu pro protein, pokud je k dispozici vhodný materiál nukleové kyseliny.Související proteiny, aby viděli, jak se od sebe liší.Jednou komplikací může být to, že proteiny mohou mít na ně vázány cukry.Tomu se nazývá glykosylace a může ovlivnit PI proteinu.Může to vypadat, že existuje více proteinů s různými isoelektrickými body, kdy ve skutečnosti existuje pouze jeden protein, který byl odlišně glykosylován.Proteiny purifikované standardními metodami, jako je chromatografie, jsou někdy analyzovány izoelektrickým zaostřením, aby se zajistila jejich čistota.