Hvad er haglgeværsekventering?
Shotgun-sekventering er en metode til DNA-sekventering, hvorved en lang strækning af DNA er fysisk opdelt i små (ca. 2.000 base-par) fragmenter, der er klonet, sekventeret og samlet ved hjælp af computeranalyse.Det blev udviklet og gjort berømt af Craig Venter fra Celera Corporation.Venter udviklede teknikken i 1996, mens han arbejdede på Institute for Genome Research.
Venter grundlagde Celera i 1998 med missionen om at sekventeres det menneskelige genom inden for tre år.Dette mål var i direkte konkurrence med det allerede driftsmæssige menneskelige genomprojekt, et konsortium af universiteter, der arbejdede sammen for at sekvensere det menneskelige genom ved hjælp af en ældre strategi kaldet MAP-baseret eller BAC-to-BAC-sekventering.Denne metode involverede først at bryde genomet i 150.000 baseparstykker kaldet BAC'er, samle BAC'erne i orden og derefter sekventering af hver BAC i detaljer.
Hele genom -haglgeværsekvensen omgår oprettelse og kortlægning af BAC'er og starter lige i med DNA -sekventering.Processen starter med at tilegne sig en prøve af DNA med høj molekylvægt fra organismen af interesse og fysisk at bryde det i små stykker ved at føre det gennem en smal gauge sprøjte eller sonicere det, en måde at bryde prøven ved hjælp af lydbølger.Shearing er en tilfældig proces, så sekvenserne af fragmenterne vil have en vis overlapning mellem dem.Forskæring skaber ikke specifikt de 2.000 baseparfragmenter, der er nødvendige til sekventering, snarere fragmenter af den ønskede størrelse skal renses fra blandingen.
Det næste trin er at tilslutte sig DNA -fragmenterne med bærer -DNA kaldet en vektor.Denne proces er kendt som kloning, og den skaber et sekventeringsbibliotek, hvorfra sekvensen af et helt genom skabes.Sekvensen af hver klon i biblioteket bestemmes, og computeranalyse bruges til at finde overlappende eller kontinuerlige sekvenser i hvert fragment.Samling af overlaps skaber en "contig", som er en lang kontinuerlig strækning af DNA -sekvens.Kloning af haglgeværet vil normalt resultere i nogle huller mellem contigs, fordi nogle sekvenser mangler på biblioteket ved en tilfældighed.Huller kan udfyldes ved at lave et nyt bibliotek eller ved at bruge kendte sekvenser til at strække sig udad fra Contig.Fordi haglgeværsekventeringssekvenser DNA -fragmenter tilfældigt, sekventeres mange fragmenter mere end én gang, hvilket skaber større sikkerhed for, at sekvensen er korrekt, end hvis hvert fragment kun var blevet sekventeret en eller to gange.
Det menneskelige genom blev sekventeret både af Human Genome -projektetved anvendelse af MAP-baseret sekventering og ved Celera ved anvendelse af haglgeværsekventering.Shotgun -sekventering er nu den foretrukne metode til andre former for genomsekventering.De fulde genomer af mange organismer, såsom planten
Arabidopsis thaliana, ris, ko, hund, kylling, chimpanse, rotte, mus, pufferfisk og mange mikroorganismer er blevet sekventeret på denne måde.