Hvordan bestemmes phosphoryleringsniveau?

Phosphoryleringsniveauet for organiske molekyler eller stoffer bestemmes af to metoder: Western blotting og massespektrometri.Phosphorylering henviser oftest til fastgørelse af et phosphat til protein.Når fosfater fastgøres til protienser, forstyrres de naturlige processer og funktioner af proteinenzymer i den menneskelige krop.Bestemmelse af phosphoryleringsniveauet er afgørende for behandling af en lang række sygdomme, fra kræft til diabetes.

Western blotting er en populær metode, der bruges til at bestemme phosphoryleringsniveauet for et bestemt sæt proteiner.Antistoffer, såsom anti-phospho-tyrosin monoklonale antistoffer, anvendes typisk, fordi de let binder til en proteiner-tyrosinrester, der påvirkes af phosphorylering.Ved Western blotting adskilles proteinerne først efter størrelse ved anvendelse af en elektrisk ladningsmetode kendt som gelelektroforese.

Proteinerne overføres derefter til en membran, der er dækket med specielle antistoffer, der binder til fosfater på proteiner.Når proteinerne er overført, vil antistofferne klæbe til eventuelle proteiner med et fastgjort fosfat.Phosphoryleringsniveauet kan derefter bestemmes af en røntgenstråle af membranen.Eventuelle berørte proteiner vil afgive en lysflink, hvilket gør det lettere for forskeren at måle phosphoryleringsniveauer.

Massespektrometri er en anden måde at måle phosphoryleringsniveauet for et stof.Denne proces omdanner proteinmolekylerne til ioner, hvilket gør dem lettere at spore og måle.Prøven ioniseres af en højdrevet ionkilde, der oversvømmer prøven med elektroner.Denne handling forvandler prøven til kationer, positivt ladede ioner.

Masseanalysatoren af massespektrometeret adskiller ionerne med deres masse og intensitet af ladning.Dette giver forskeren mulighed for at opdage forholdet mellem masse og ladning, hvilket er kritisk for at opdage fosforyleringsniveauet for prøven.Endelig måler detektoren ionerne i orden, så dataene kan vises i diagramform.Diagrammet viser forholdet mellem masse og opladning af ionerne på X-aksen og den relative intensitet af ionerne på Y-aksen.

Phosphoryleringsniveauer kan også måles under substratphosphorylering.Substratphosphorylering er en proces, der skaber adenosintriphosphat (ATP), et molekyle, der er kritisk for energioverførsel blandt celler, under glycolyse.Denne proces forekommer i både dyreceller og planteceller.

I planteceller oprettes ATP -molekyler ved anvendelse af energi fra solen.Denne energi sporer phosphorylering i planterne chloroplaster, stedet for plantet fotosyntese.Niveauet af phosphorylering korrelerer med den mængde fosfat, der er nødvendig for at skabe yderligere ATP -molekyler.