Hvad er det isoelektriske punkt?

Proteiner er bygget af kæder af aminosyrer, som hver har forskellige pH -værdier.Proteinets samlede pH er sammensat af blandingen af pH -værdierne for de individuelle aminosyrer, når de danner ioner i den bestemte opløsning, hvor de opløses.Det isoelektriske punkt (PI) af et protein er den pH, hvor proteinet ikke har nogen nettoopladning.Denne egenskab kan udnyttes til at adskille proteinet med den kendte PI fra andre proteiner i en heterogen blanding.

Aminosyrer har en aminoterminalgruppe, der er basisk med en høj pH.Den anden ende af aminosyren er den carboxylterminal, der er sur, med en lav pH.Ved forskellige pH -værdier varierer aminosyrerne på proteinerne i deres ladninger.Proteiner under deres isoelektriske punkt har en positiv ladning.I modsætning hertil har de over dette punkt en negativ ladning.

For at udnytte viden om det isoelektriske punkt til proteinoprensning udsættes en blanding af proteiner for et elektrisk felt.Dette gøres ofte i agarose- eller polyacrylamidgeler og er kendt som isoelektrisk fokusering.En ældre teknik er at udføre proceduren i større skala i en glasskolonne ved hjælp af en opløsning af saccharose med elektroder i hver ende.Forbindelser kaldet amfolytter tilsættes, der forårsager dannelse af en konsistent pH -gradient.Når gelen eller søjlen udsættes for den elektriske strøm, migrerer proteinerne, indtil de når deres isoelektriske punkt, og forbliver derefter stationære.

Proteiner på geler syntes generelt af et farvestof, der binder proteiner.Nogle gange, hvis enzymer undersøges, kan der anvendes et underlag, der giver en farvet reaktion.Normalt anvendes standarder, der har proteiner med kendte isoelektriske punkter.

Når man ved, hvor det ønskede protein er placeret, er en almindelig teknik at skære det isolerede protein ud af gelen.Proteinet kan derefter oprenses og sekventeres.Når sekvensen er kendt, kan den bruges til at designe primere til polymerasekædereaktionen (PCR) og bruges til at klone genet til proteinet, hvis der er passende nukleinsyremateriale til rådighed.

Isoelektrisk fokus er også en almindelig måde at analysere tæt påRelaterede proteiner for at se, hvor forskellige de er fra hinanden.En komplikation kan være, at proteiner kan have sukker, der er bundet til dem.Dette kaldes glycosylering og kan påvirke proteinets PI.Det kan se ud som om der er flere proteiner med forskellige isoelektriske punkter, når der faktisk kun er et protein, der er blevet differentielt glycosyleret.Proteiner oprenset ved standardmetoder såsom kromatografi analyseres undertiden ved isoelektrisk fokusering for at sikre deres renhed.