Cos'è il sequenziamento del bisolfito?

Il sequenziamento del bisolfito è un metodo in cui vengono analizzate diverse regioni di DNA usando la metilazione.La metilazione è il processo di aggiunta di una molecola specifica, chiamata gruppo metilico, a un nucleotide, in questo caso di solito una citosina.I nucleotidi inattivi sono spesso metilati, quindi questo metodo può essere utilizzato per una varietà di scopi, dalla determinazione delle regioni attive di un genoma alle regioni ricche di geni.Nel sequenziamento del bisolfito, le citosine metilate non sono influenzate dal processo di sequenziamento, mentre le citosine non metilate vengono convertite in uracile, un nucleotide non si trova di solito nel materiale genetico, acido desossiribonucleico (DNA.)

Questo metodo è molto sensibile alle variazioni inLa metilazione, quindi piccoli cambiamenti nel legame possono fornire ai ricercatori informazioni specifiche su determinati nucleotidi.Il bisolfito di sodio converte la citosina in uracile, ma la conversione avviene in un ambiente in cui la citosina metilata non subirà questo cambiamento.Quando il sequenziamento del bisolfito è completo, il DNA originale è stato convertito in una molecola significativamente diversa.Le citosine saranno notevolmente esaurite o potenzialmente assenti.Se in questa molecola convertita si trova ancora una citosina, rappresenta una citosina naturalmente metilata nel genoma in esame.

Come tutti i protocolli sperimentali, il sequenziamento del bisolfito presenta svantaggi.Il suo svantaggio più significativo è che richiede una concentrazione di sale molto elevata per funzionare correttamente.Il sale incoraggia la ricottura del DNA a singolo filamento nella sua doppia elica più naturale e il bisolfito di sodio non può sempre raggiungere le citosine quando fanno parte del DNA a doppio filamento.Se la concentrazione di sale è troppo alta, un numero di citosine non può essere convertita in uracile, con conseguente falsa identificazione delle citosine metilate all'interno di un genoma.Gli agenti di denaturazione possono essere necessari per ridurre al minimo il numero di identificazioni false positive.

Non sono necessarie grandi quantità di dati genomici per il sequenziamento del bisolfito, quindi il metodo ha un'applicazione utile analizzando campioni clinici.La sorgente di acido nucleico originale non ha importanza, ma la fonte deve essere DNA.In teoria, l'acido ribonucleico (RNA) potrebbe essere sequenziato usando questo metodo, poiché la maggior parte dell'RNA è a filatura e non sarebbe così suscettibile ai falsi positivi a causa di nucleotidi bloccati.Se messo in pratica, tuttavia, il sequenziamento del bisolfito non è utile per l'RNA, perché l'RNA ha naturalmente uracile.Senza una sorta di marcatura esterna o aggiunta al protocollo, le citosine convertite sarebbero indistinguibili da Uracile naturale.

Quando si intraprendono qualsiasi tipo di metodologia di sequenziamento, accuratezza e precisione sono essenziali.Metodi sensibili come il sequenziamento del bisolfito offrono un mezzo affidabile di analisi della sequenza, che a sua volta consente l'analisi genica e l'identificazione di obiettivi per farmaci e terapie.Sebbene questo metodo non possa essere usato su persone viventi, può comunque essere di grande aiuto solo con i più piccoli campioni di tessuto con cui lavorare.