Cos'è il sequenziamento dei fucili da caccia?
Il sequenziamento del fucile è un metodo di sequenziamento del DNA in base al quale un lungo tratto di DNA viene interrotto fisicamente in piccoli frammenti (circa 2.000 coppie di base) che sono clonati, sequenziati e assemblati usando l'analisi del computer.È stato sviluppato e reso famoso da Craig Venter di Celera Corporation.Venter ha sviluppato la tecnica nel 1996 mentre lavorava presso l'Institute for Genome Research.
Venter ha fondato Celera nel 1998 con la missione di sequenziamento del genoma umano entro tre anni.Questo obiettivo era in diretta competizione con il già operativo progetto del genoma umano, un consorzio di università che lavorano insieme per sequenziare il genoma umano usando una strategia più vecchia chiamata sequenziamento basato su MAP o BAC-to-BAC.Questo metodo ha comportato prima la rottura del genoma in 150.000 pezzi di coppia di basi chiamati BACS, assemblando i BAC in ordine e quindi sequenziando ogni BAC in dettaglio.
Il sequenziamento del fucile del genoma intero bypassa la creazione e la mappatura di BACS e inizia subito con il sequenziamento del DNA.Il processo inizia con l'acquisizione di un campione di DNA ad alto peso molecolare dall'organismo di interesse e la rompela fisicamente in piccoli pezzi passandolo attraverso una siringa a scartamento stretto o sonicando, un modo per rompere il campione usando onde sonore.Il taglio è un processo casuale, quindi le sequenze dei frammenti avranno una certa sovrapposizione tra di loro.La taglio non crea specificamente i frammenti di coppia di basi necessari per il sequenziamento, piuttosto che frammenti della dimensione desiderata devono essere purificati dalla miscela.
Il passo successivo è unirsi ai frammenti di DNA con DNA portante chiamato vettore.Questo processo è noto come clonazione e crea una libreria di sequenziamento da cui creerà la sequenza di un intero genoma.Viene determinata la sequenza di ciascun clone nella libreria e l'analisi del computer viene utilizzata per trovare sequenze sovrapposte o continue in ciascun frammento.L'assemblaggio delle sovrapposizioni crea un "contig", che è un lungo tratto continuo di sequenza di DNA.
La clonazione del fucile da caccia di solito si tradurrà in alcune lacune tra i contig perché mancano per caso alcune sequenze dalla biblioteca.Le lacune possono essere colpite creando una nuova libreria o utilizzando sequenze note per estendersi verso l'esterno dal contig.Poiché a caso sequenze di sequenziamento del fucile da caccia, molti frammenti vengono sequenziati più di una volta, creando maggiore certezza che la sequenza è corretta che se ogni frammento fosse stato sequenziato solo una o due volte.
Il genoma umano è stato sequenziato sia dal progetto del genoma umanoUtilizzo del sequenziamento basato su mappe e di Celera usando il sequenziamento del fucile.Il sequenziamento dei fucili da caccia è ora il metodo preferito per altri tipi di sequenziamento del genoma.I genomi completi di molti organismi, come la pianta Arabidopsis thaliana , riso, mucca, cane, pollo, scimpanzé, ratto, topo, pesce palla e molti microrganismi sono stati sequenziati in questo modo.