Come viene determinato il livello di fosforilazione?
Il livello di fosforilazione di molecole o sostanze organiche è determinato con due metodi: Western Blotting e Spectrometry di massa.La fosforilazione si riferisce più spesso all'attaccamento di un fosfato alla proteina.Quando i fosfati si attaccano ai protieni, i processi naturali e le funzioni degli enzimi proteici all'interno del corpo umano sono disturbati.Determinare il livello di fosforilazione è fondamentale per il trattamento di una vasta gamma di malattie, dal cancro al diabete.
La macchia occidentale è un metodo popolare utilizzato per determinare il livello di fosforilazione di una particolare serie di proteine.Anticorpi come gli anticorpi monoclonali anti-fosfo-tirosina sono in genere usati perché si legano facilmente a un residui di tirosina di proteine, che sono influenzati dalla fosforilazione.Nella macchia occidentale, le proteine vengono prima separate per dimensioni usando un metodo di carica elettrico noto come elettroforesi su gel.
Le proteine vengono quindi trasferite su una membrana che è stata coperta da anticorpi speciali che si legano ai fosfati sulle proteine.Una volta trasferite le proteine, gli anticorpi si attaccheranno a qualsiasi proteina con un fosfato attaccato.Il livello di fosforilazione può quindi essere determinato da un raggio X della membrana.Eventuali proteine interessate emetteranno un lampo di luce, rendendo più facile per il ricercatore misurare i livelli di fosforilazione.
La spettrometria di massa è un altro modo per misurare il livello di fosforilazione di una sostanza.Questo processo converte le molecole proteiche in ioni, il che le rende più facili da tracciare e misurare.Il campione viene ionizzato da una sorgente ionica ad alta potenza che inonda il campione con elettroni.Questa azione trasforma il campione in cationi, ioni caricati positivamente.
L'analizzatore di massa dello spettrometro di massa separa gli ioni per massa e intensità di carica.Ciò consente al ricercatore di scoprire il rapporto massa a carica, che è fondamentale per scoprire il livello di fosforilazione del campione.Infine, il rivelatore misura gli ioni in ordine in modo che i dati possano essere visualizzati nel modulo grafico.Il grafico mostra il rapporto massa a carica degli ioni sull'asse X e l'intensità relativa degli ioni sull'asse y.
I livelli di fosforilazione possono anche essere misurati durante la fosforilazione del substrato.La fosforilazione del substrato è un processo che crea adenosina trifosfato (ATP), una molecola critica per il trasferimento di energia tra le cellule, durante la glicolisi.Questo processo si verifica sia nelle cellule animali che nelle cellule vegetali.
Nelle cellule vegetali, le molecole ATP vengono create usando energia dal sole.Questa energia stimola la fosforilazione nei cloroplasti delle piante, il sito della fotosintesi delle piante.Il livello di fosforilazione è correlato alla quantità di fosfato necessaria per creare ulteriori molecole ATP.