Cos'è una macchia settentrionale?
L'ibridazione della macchia settentrionale è una tecnica utilizzata per rilevare i livelli di RNA di messaggero (mRNA) in un campione e per quantificare la quantità di mRNA presente.Sebbene esistano altre tecniche più potenti, Northern Blot rimane lo standard grazie alla sua semplicità e facilità d'uso.La tecnica di macchia settentrionale consente anche il confronto diretto di più campioni in un singolo esperimento.
L'RNA messenger è un tipo di acido nucleico che viene prodotto quando viene espresso un gene.Un gene che viene acceso e funzionale all'interno di una cellula viene trascritto nell'mRNA.L'mRNA viene quindi trasportato nel citoplasma della cellula, dove viene tradotto in una proteina.L'analisi Northern Blot di un campione di mRNA cellulare può quindi fornire informazioni utili sull'array di proteine che la cellula sta producendo.
In una macchia settentrionale, l'mRNA viene estratto dalle cellule e eseguito attraverso un'elettroforesi di gel di agarosio denaturante, che consente all'mRNA nel campioneessere separato in base alle dimensioni.Campioni di molecole di mRNA di dimensioni note vengono eseguiti contemporaneamente per fornire un controllo.Una volta completata l'elettroforesi, i campioni vengono trasferiti e immobilizzati su una membrana solida, tipicamente realizzata con un materiale come il nylon.I campioni vengono quindi esposti a sonde radiomarcate per diverse ore prima dell'analisi.Durante l'analisi, l'mRNA che ha ibridato a una sonda radiomarcata può essere chiaramente rilevato usando la radiografia.
La tecnica di macchia settentrionale consente l'osservazione dei modelli di espressione genica tra diversi tipi di tessuto.È possibile confrontare l'RNA di messaggero estratto da cellule di vari tessuti e tipi di organi e le risposte cellulari allo stress, all'infezione e molti altri stimoli possono essere esaminati.Osservando le differenze nell'espressione dell'mRNA in condizioni diverse, uno scienziato può determinare quali tipi di proteine produce una cellula in risposta a determinati stimoli.Ciò può fornire indizi sulle funzioni di proteine sconosciute o, nel caso di proteine note, informazioni sulle risposte cellulari agli stimoli in questione.
Ad esempio, una macchia settentrionale può mostrare che l'espressione di una proteina sconosciuta aumenta in risposta alla presenza di una tossina specifica.Si potrebbe quindi teorizzare che la proteina è coinvolta nella riduzione della tossicità, forse trasportando la sostanza chimica dalla cellula o convertendola in un metabolita.Se le proteine note sono in esame, documentare i cambiamenti nell'espressione delle proteine può fornire informazioni sulla risposta stessa.Se l'espressione di un trasportatore molecolare noto è aumentata, ad esempio, si potrebbe confermare che la risposta cellulare alla tossina è quella di trasportare la tossina fuori dalla cellula.