Hoe wordt het fosforylatieniveau bepaald?
Het fosforylatieniveau van organische moleculen of stoffen wordt bepaald door twee methoden: Western -blotting en massaspectrometrie.Fosforylering verwijst meestal naar de hechting van een fosfaat aan eiwit.Wanneer fosfaten zich hechten aan protiens, worden de natuurlijke processen en functies van eiwit -enzymen in het menselijk lichaam verstoord.Het bepalen van het fosforylatieniveau is cruciaal voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, van kanker tot diabetes.
Western -blotting is een populaire methode die wordt gebruikt om het fosforyleringsniveau van een bepaalde set eiwitten te bepalen.Antilichamen zoals anti-fosfo-tyrosinemonoklonale antilichamen worden typisch gebruikt omdat ze gemakkelijk binden aan een eiwitten tyrosineresten, die worden beïnvloed door fosforylering.Bij Western -blotting worden de eiwitten eerst gescheiden door grootte met behulp van een elektrische ladingsmethode die bekend staat als gelelektroforese.
De eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan dat is bedekt met speciale antilichamen die binden aan fosfaten op eiwitten.Zodra de eiwitten zijn overgedragen, blijven de antilichamen vasthouden aan eventuele eiwitten met een bevestigd fosfaat.Het fosforylatieniveau kan vervolgens worden bepaald door een röntgenfoto van het membraan.Alle aangetaste eiwitten geven een lichtflits af, waardoor het voor de onderzoeker gemakkelijker wordt om fosforylatieniveaus te meten.
Massaspectrometrie is een andere manier om het fosforylatieniveau van een stof te meten.Dit proces zet de eiwitmoleculen om in ionen, waardoor ze gemakkelijker te volgen en te meten zijn.Het monster wordt geïoniseerd door een krachtige ionenbron die het monster met elektronen overspoelt.Deze actie verandert het monster in kationen, positief geladen ionen.
De massa -analysator van de massaspectrometer scheidt de ionen door hun massa en intensiteit van lading.Hierdoor kan de onderzoeker de massa-lading verhouding ontdekken, wat van cruciaal belang is bij het ontdekken van het fosforylatieniveau van het monster.Ten slotte meet de detector de ionen in volgorde zodat de gegevens in grafiekvorm kunnen worden weergegeven.De grafiek toont de massa-lading-verhouding van de ionen op de x-as en de relatieve intensiteit van de ionen op de y-as.
Fosforylatieniveaus kunnen ook worden gemeten tijdens substraatfosforylering.Substraatfosforylering is een proces dat adenosinetrifosfaat (ATP) creëert, een molecuul dat cruciaal is voor energieoverdracht tussen cellen, tijdens glycolyse.Dit proces vindt plaats in zowel diercellen als plantencellen.
In plantencellen worden ATP -moleculen gecreëerd door energie uit de zon te gebruiken.Deze energie spoort fosforylering in de plantenchloroplasten, de plaats van fotosynthese van planten.Het niveau van fosforylering correleert met de hoeveelheid fosfaat die nodig is om extra ATP -moleculen te creëren.