Hvordan bestemmes fosforyleringsnivå?

Fosforyleringsnivået av organiske molekyler eller stoffer bestemmes ved to metoder: Western blotting og massespektrometri.Fosforylering refererer oftest til feste av et fosfat til protein.Når fosfater festes til protiens, forstyrres de naturlige prosessene og funksjonene til proteinenzymer i menneskekroppen.Å bestemme fosforyleringsnivået er avgjørende for å behandle et bredt spekter av sykdommer, fra kreft til diabetes.

Western blotting er en populær metode som brukes for å bestemme fosforyleringsnivået til et bestemt sett med proteiner.Antistoffer som antifosfo-tyrosinmonoklonale antistoffer brukes vanligvis fordi de lett binder seg til et proteiner tyrosinrester, som påvirkes av fosforylering.I Western blotting blir proteinene først separert ved størrelse ved bruk av en elektrisk ladningsmetode kjent som gelelektroforese.

Proteinene blir deretter overført til en membran som har blitt dekket med spesielle antistoffer som binder seg til fosfater på proteiner.Når proteinene er overført, vil antistoffene holde seg til proteiner med et festet fosfat.Fosforyleringsnivået kan deretter bestemmes av en røntgen av membranen.Eventuelle berørte proteiner vil gi fra seg et lysglimt, noe som gjør det lettere for forskeren å måle fosforyleringsnivåer.

Massespektrometri er en annen måte å måle fosforyleringsnivået til et stoff.Denne prosessen konverterer proteinmolekylene til ioner, noe som gjør dem lettere å spore og måle.Prøven ioniseres av en høydrevet ionekilde som oversvømmer prøven med elektroner.Denne handlingen gjør prøven til kationer, positivt ladede ioner.

Masseanalysatoren av massespektrometeret skiller ionene med deres masse og ladningsintensitet.Dette gjør at forskeren kan oppdage masse-til-ladningsforholdet, som er avgjørende for å oppdage fosforyleringsnivået til prøven.Til slutt måler detektoren ionene i rekkefølge slik at dataene kan vises i kartform.Diagrammet viser masse-til-ladningsforholdet til ionene på x-aksen, og den relative intensiteten til ionene på y-aksen.

Fosforyleringsnivåer kan også måles under substratfosforylering.Substratfosforylering er en prosess som skaper adenosintrifosfat (ATP), et molekyl som er kritisk for energioverføring mellom celler, under glykolyse.Denne prosessen forekommer i både dyreceller og planteceller.

I planteceller skapes ATP -molekyler ved å bruke energi fra solen.Denne energien ansporer fosforylering i plantene kloroplaster, stedet for plantefotosyntese.Fosforyleringsnivået korrelerer med mengden fosfat som er nødvendig for å lage ytterligere ATP -molekyler.