Hva er de forskjellige metodene for proteinkonsentrasjonsbestemmelse?

Det er hundrevis av forskjellige metoder for bestemmelse av proteinkonsentrasjon.Det utrolige mangfoldet i de typer proteinløsninger som biokjemikere analyserer er grunnen til at det ikke er noen enkelt universell metode som fungerer for alle typer proteinløsninger.De vanligste proteinanalysene er Bradford -analysen, Lowry -analysen og bicinchoninsyreanalysen.Likevel er utallige variasjoner utviklet etter behov for å jobbe rundt potensielle kjemiske uforenligheter mellom proteinløsningen og reagensene som blir brukt i analysen.

Generelt sett er det to hovedkategorier av analyser for proteinkonsentrasjonsbestemmelse.I den første gruppen av metoder tilsettes et fargerikt eller fluorescerende fargestoff til en proteinløsning, og det binder seg spesielt til protein.Det bundne fargestoffet har en unik absorpsjonsbølgelengde som er proporsjonal med mengden protein.Ved å bruke et spektrometer blir det mulig å estimere konsentrasjonen av protein.

Den andre gruppen av analyser innebærer tilsetning av kobber (II) -ioner til en løsning av protein, hvor disse ionene reduseres til kobber (I) -ioner.Disse reduserte ionene er da i stand til å danne fargerike komplekser ved å binde til proteiner.I denne analysen tilsettes et rødt fargestoff kalt Coomassie Brilliant Blue til en proteinoppløsning under sure forhold.Når dette fargestoffet binder seg til protein, danner det et permanent blått kompleks med en karakteristisk absorbans ved 595 nanometer.

Til tross for den generelle allsidigheten til Bradford -analysen, er det uforenlig med noen proteinløsninger.Spesielt blir Bradford -analysen forstyrret av tilstedeværelsen av natriumdodecylsulfat (SDS), et vaskemiddel som ofte brukes til å rense proteiner og bryte ned celler ved lysering.Dette vaskemiddelet forstyrrer bindingen av fargestoffet til proteiner, noe som resulterer i en upålitelig og unøyaktig absorpsjonsavlesning.Andre typer metoder må da brukes når SDS er til stede.

En annen serie proteinanalyser er utviklet, og de involverer alle en variant av biuret -testen.I denne reaksjonen er et protein kombinert med en vandig base og kobber (II) -ioner.Disse ionene reduseres og deretter chelateres med protein for å danne fargerike komplekser.To analyser som bruker denne testen er Lowry-analysen og bicinchoninsyreanalysen.

Med Lowry-analysen tilsettes et Folin-Ciocalteu-reagens til Biuret-testen.Folin-ciocalteu-reagenset oksiderer aromatiske rester, spesielt tryptofan, og hjelper komplekset med å absorbere sterkt ved 750 nanometer.Bicinchoninic acid -analysen innebærer derimot tilsetning av bicinchoninsyre til biuret -testen.Etter en kort inkubasjon på omtrent 104 og deg;Fahrenheit (40 deg; Celsius), to ekvivalenter av syre og peptidbindinger av proteinet chelater et enkelt kobber (I) ion.Resultatet er et kompleks som absorberer sterkt ved 562 nanometer.

Når du velger en metode for proteinkonsentrasjonsbestemmelse, er det viktig for en å vurdere de forskjellige kjemiske funksjonelle gruppene som er til stede i løsningen.Tilstedeværelsen av visse aminosyresidekjeder, disulfidbindinger og kofaktorer kan gjøre proteinkonsentrasjonsbestemmelsen vilt unøyaktig.Det er ofte nødvendig for en å ikke bare vurdere proteinene, men også andre reagenser og buffere, for eksempel å redusere midler og vaskemidler.Den ideelle metoden vil være kjemisk kompatibel og være pålitelig, billig og enkel å sette opp.