Vad är hagelgevärsekvensering?

Shotgun-sekvensering är en metod för DNA-sekvensering varigenom en lång DNA-sträcka fysiskt bryts i små (cirka 2 000 baspar) fragment som klonas, sekvenseras och monteras med hjälp av datoranalys.Det utvecklades och berömd av Craig Venter från Celera Corporation.Venter utvecklade tekniken 1996 när han arbetade på Institute for Genome Research.

Venter grundade Celera 1998 med uppdraget att sekvensera det mänskliga genomet inom tre år.Detta mål var i direkt konkurrens med det redan operativa mänskliga genomprojektet, ett konsortium av universitet som arbetade tillsammans för att sekvensera det mänskliga genomet med en äldre strategi som kallas kartbaserad eller BAC-till-BAC-sekvensering.Denna metod involverade först genom att bryta genomet i 150 000 basparstycken som kallas BACS, monterade BACS i ordning och sedan sekvensering av varje BAC i detalj.

Hela genom -hagelgevärsekvensering kringgår skapandet och kartläggningen av BAC och börjar rätt i DNA -sekvensering.Processen börjar med att skaffa ett prov av DNA med hög molekylvikt från organismen av intresse och fysiskt bryta det i små bitar genom att passera den genom en smal mätspruta eller sonikera det, ett sätt att bryta provet med ljudvågor.Skjuvning är en slumpmässig process, så sekvenserna av fragmenten kommer att ha viss överlappning mellan dem.Skjuvning skapar inte specifikt de 2 000 basparfragmenten som behövs för sekvensering, snarare fragment av önskad storlek måste renas från blandningen.

Nästa steg är att gå med i DNA -fragmenten med bärar -DNA som kallas en vektor.Denna process kallas kloning, och den skapar ett sekvenseringsbibliotek från vilket sekvensen för ett helt genom kommer att skapas.Sekvensen för varje klon i biblioteket bestäms och datoranalys används för att hitta överlappning eller kontinuerliga sekvenser i varje fragment.Montering av överlappningar skapar en "contig", som är en lång kontinuerlig sträcka av DNA -sekvens.

hagelgevär kloning kommer vanligtvis att resultera i vissa luckor mellan kontiger eftersom vissa sekvenser saknas från biblioteket av en slump.Gap kan fyllas genom att göra ett nytt bibliotek eller genom att använda kända sekvenser för att sträcka sig utåt från kontig.Eftersom hagelgevär sekvenseringssekvenser DNA -fragment slumpmässigt, sekvenseras många fragment mer än en gång, vilket skapar större säkerhet att sekvensen är korrekt än om varje fragment endast hade sekvenserats en eller två gånger.

Det mänskliga genomet sekvenserades båda av det mänskliga genomprojektetAnvända kartbaserad sekvensering och med Celera med hjälp av hagelgevärsekvensering.Shotgun -sekvensering är nu den föredragna metoden för andra typer av genomsekvensering.De fullständiga genomerna av många organismer, såsom växten Arabidopsis thaliana , ris, ko, hund, kyckling, schimpans, råtta, mus, pufferfisk och många mikroorganismer har sekvenserats på detta sätt.