Hur bestäms fosforyleringsnivån?

Fosforyleringsnivån för organiska molekyler eller ämnen bestäms med två metoder: Western blotting och masspektrometri.Fosforylering hänvisar oftast till fästningen av ett fosfat till protein.När fosfater fästs vid protienser störs de naturliga processerna och funktionerna hos proteinenzymer i människokroppen.Att bestämma fosforyleringsnivån är avgörande för att behandla ett brett spektrum av sjukdomar, från cancer till diabetes.

Western blotting är en populär metod som används för att bestämma fosforyleringsnivån för en viss uppsättning proteiner.Antikroppar såsom monoklonala antikroppar mot fosfosin-tyrosin används vanligtvis eftersom de lätt binder till en proteins tyrosinrester, som påverkas av fosforylering.Vid Western blotting separeras proteinerna först efter storlek med användning av en elektrisk laddningsmetod känd som gelelektrofores.

Proteinerna överförs sedan till ett membran som har täckts med speciella antikroppar som binder till fosfater på proteiner.När proteinerna har överförts kommer antikropparna att hålla sig till alla proteiner med ett fäst fosfat.Fosforyleringsnivån kan sedan bestämmas av en röntgenstråle av membranet.Eventuella drabbade proteiner kommer att ge upp en blixt av ljus, vilket gör det lättare för forskaren att mäta fosforyleringsnivåer.

Masspektrometri är ett annat sätt att mäta fosforyleringsnivån för ett ämne.Denna process omvandlar proteinmolekylerna till joner, vilket gör dem enklare att spåra och mäta.Provet är joniserat av en högdriven jonkälla som översvämmer provet med elektroner.Denna åtgärd förvandlar provet till katjoner, positivt laddade joner.

Massanalysatorn för masspektrometern skiljer jonerna med deras massa och laddningsintensitet.Detta gör det möjligt för forskaren att upptäcka mass-till-laddningsförhållandet, vilket är avgörande för att upptäcka fosforyleringsnivån för provet.Slutligen mäter detektorn jonerna i ordning så att data kan visas i diagramform.Diagrammet visar mass-till-laddningsförhållandet för jonerna på x-axeln och jonernas relativa intensitet på y-axeln.

Fosforyleringsnivåer kan också mätas under substratfosforylering.Substratfosforylering är en process som skapar adenosintrifosfat (ATP), en molekyl som är kritisk för energiöverföring mellan celler, under glykolys.Denna process sker i både djurceller och växtceller.

I växtceller skapas ATP -molekyler genom att använda energi från solen.Denna energi sporrar fosforylering i växterna kloroplaster, platsen för växtfotosyntes.Nivån på fosforylering korrelerar med mängden fosfat som behövs för att skapa ytterligare ATP -molekyler.