Vilka är de olika metoderna för proteinkoncentrationsbestämning?
Det finns hundratals olika metoder för bestämning av proteinkoncentration.Den otroliga mångfalden i de typer av proteinlösningar som biokemister analyserar är varför det inte finns någon enda universell metod som fungerar för alla typer av proteinlösningar.De vanligaste proteinanalyserna är Bradford -analysen, Lowry -analysen och bicinchoninsyranalysen.Icke desto mindre har otaliga variationer utvecklats efter behov för att arbeta kring eventuella kemiska inkompatibiliteter mellan proteinlösningen och reagensen som används i analysen.
Generellt finns det två huvudkategorier av analyser för proteinkoncentration.I den första gruppen av metoder tillsätts ett färgstark eller fluorescerande färgämne till en proteinlösning, och det binder specifikt till protein.Det bundna färgämnet har en unik absorptionsvåglängd som är proportionell mot mängden protein.Genom att använda en spektrometer blir det möjligt att uppskatta koncentrationen av protein.
Den andra gruppen av analyser involverar tillsats av koppar (II) joner till en lösning av protein, där dessa joner reduceras till koppar (I) joner.Dessa reducerade joner kan sedan bilda färgglada komplex genom att binda till proteiner.Genom att mäta absorbanserna vid deras unika våglängder kan proteinkoncentrationerna också dras.
En av de mest populära metoderna för proteinkoncentrationsbestämning är Bradford -analysen.I denna analys tillsätts ett rött färgämne som kallas Coomassie Brilliant Blue till en proteinlösning under sura förhållanden.När detta färgämne binder till protein bildar det ett permanent blått komplex med en karakteristisk absorbans vid 595 nanometer.
Trots den allmänna mångsidigheten i Bradford -analysen är det oförenligt med vissa proteinlösningar.I synnerhet störs Bradford -analysen av närvaron av natriumdodecylsulfat (SDS), ett tvättmedel som vanligtvis används för att rena proteiner och bryta ner celler genom lys.Detta tvättmedel stör bindningen av färgämnet till proteiner, vilket resulterar i en opålitlig och felaktig absorptionsavläsning.Andra typer av metoder måste då användas när SDS är närvarande.
En annan serie proteinanalyser har utvecklats och de involverar alla en variation av Biuret -testet.I denna reaktion kombineras ett protein med en vattenhaltig bas och koppar (II) joner.Dessa joner reduceras och keleras sedan av protein för att bilda färgglada komplex.Två analyser som använder detta test är Lowry-analysen och bicinchoninsyranalysen.
Med Lowry-analysen läggs ett folin-ciocalteu-reagens till Biuret-testet.Folin-ciocalteu-reagenset oxiderar aromatiska rester, särskilt tryptofan, och hjälper komplexet att absorbera starkt vid 750 nanometer.Bicinchoninsyranalysen, å andra sidan, involverar tillsats av bicinchoninic acid till biuret -testet.Efter en kort inkubation vid cirka 104 deg;Fahrenheit (40 deg; celsius), två ekvivalenter av syra och peptidbindningarna hos proteinet chelat en enda koppar (I) -jon.Resultatet är ett komplex som absorberar starkt vid 562 nanometrar.
När du väljer en metod för proteinkoncentrationsbestämning är det viktigt för en att överväga de olika kemiska funktionella grupperna som finns i lösningen.Närvaron av vissa aminosyrasidokedjor, disulfidbindningar och kofaktorer kan göra proteinkoncentrationsbestämningen vild felaktig.Det är ofta nödvändigt för en att överväga inte bara proteinerna utan också andra reagens och buffertar, såsom reducerande medel och tvättmedel.Den ideala metoden kommer att vara kemiskt kompatibel och vara pålitlig, billig och enkel att ställa in.