นิโคตินสามารถตรวจพบได้จากการทดสอบต่างๆที่วัดระดับของสารเคมีที่เรียกว่าโคตินิน ร่างกายผลิตโคตินินเฉพาะเมื่อนิโคตินเข้าสู่ร่างกายเช่นผ่านการใช้บุหรี่ยาสูบท่อยาสูบกลิ่นซิการ์ซิการ์หรือเคี้ยวยาสูบ สามารถตรวจพบ Cotinine ได้โดยการทดสอบเลือดเส้นผมน้ำลายหรือปัสสาวะของบุคคล ผลการทดสอบสามารถแสดงได้ว่าบุคคลนั้นเป็นผู้ใช้ยาสูบปัจจุบันหรือผู้ใช้เดิม
มีสาเหตุหลายประการที่อาจทำการทดสอบนิโคติน บางครั้งผู้ปกครองใช้แบบทดสอบเพื่อตัดสินว่าลูกของพวกเขาสูบบุหรี่หรือไม่ ผู้ให้บริการประกันสุขภาพของ บริษัท บางแห่งจำเป็นต้องทำการทดสอบนิโคตินเพื่อประเมินความเสี่ยงด้านสุขภาพของพนักงาน การทดสอบสามารถใช้ในโปรแกรมการเลิกสูบบุหรี่ในกรณีการดูแลเด็กเมื่อผู้สมัครประกันชีวิตหรือเพื่อการวิจัย
การทดสอบปัสสาวะเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการทดสอบนิโคติน ระดับของโคตินินในปัสสาวะวัดโดยใช้แถบทดสอบหรือวางปัสสาวะสักสองสามหยดลงบนแผ่นทดสอบ โคตินินที่มีปัสสาวะทำปฏิกิริยากับวัสดุทดสอบเพื่อแสดงผลบวกหรือลบ ชุดทดสอบยาเสพติดในบ้านมีจำหน่ายที่ร้านขายยาหรือผ่านอินเทอร์เน็ตสำหรับผู้ที่ต้องการทำการทดสอบนิโคตินแบบส่วนตัว การทดสอบนิโคตินในปัสสาวะนั้นสามารถใช้งานได้ประมาณสี่วันหลังจากผู้ใช้ยาสูบคนสุดท้าย
การประเมินน้ำลายสำหรับการทดสอบนิโคตินเป็นกระบวนการที่คล้ายกับการทดสอบปัสสาวะ สำหรับการประเมินนี้ตัวอย่างน้ำลายจะถูกวางลงบนแถบทดสอบและให้ผลลัพธ์ในเวลาประมาณครึ่งชั่วโมง แม้ว่าการทดสอบนิโคตินในน้ำลายจะให้ผลลัพธ์ที่ถูกต้องและสม่ำเสมอ แต่อาจแสดงผลในเชิงบวกจากการสัมผัสกับควันมือสอง บางครั้งผู้ปกครองใช้ชุดทดสอบบ้านน้ำลายเพื่อตรวจสอบว่าลูกของพวกเขาสูบบุหรี่หรือไม่
การวิเคราะห์เลือดสำหรับการทดสอบนิโคตินนั้นไม่น่าเชื่อถือเท่ากับการทดสอบปัสสาวะหรือน้ำลาย เมื่อบุคคลใช้ยาสูบระดับนิโคตินในเลือดจะเพิ่มขึ้นเกือบจะในทันทีและยังคงอยู่นานกว่าสองสัปดาห์ ระดับของนิโคตินที่แสดงในเลือดอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับการเผาผลาญของแต่ละบุคคลประเภทของยาสูบที่ใช้และการสูดดมควัน นายจ้างบางรายชอบประเมินเลือดเพราะพวกเขาสามารถตรวจหานิโคตินและยาผิดกฎหมายได้ในเวลาเดียวกัน
Cotinine สามารถอยู่ในรูขุมขนได้นานถึงหนึ่งปีหลังจากที่ผู้คนหยุดใช้ยาสูบ การทดสอบนิโคตินกับตัวอย่างผมนั้นมีค่าใช้จ่ายสูงและไม่ค่อยมีการใช้งานโดย บริษัท ประกันภัยหรือนายจ้าง โดยทั่วไปจะ จำกัด อยู่ที่การวิจัยที่วัดผลกระทบของควันบุหรี่มือสองต่อผู้ไม่สูบบุหรี่ ขนจากส่วนใดของร่างกายเหมาะสำหรับการทดสอบประเภทนี้
