Was ist der isoelektrische Punkt?

Proteine werden aus Aminosäurenketten gebaut, von denen jeweils unterschiedliche pH -Werte aufweisen.Der Gesamt -pH -Wert des Proteins besteht aus der Mischung der pH -Werte der einzelnen Aminosäuren, die Ionen in der jeweiligen Lösung bilden, in der sie gelöst sind.Der isoelektrische Punkt (PI) eines Proteins ist der pH -Wert, bei dem dieses Protein keine Nettoladung hat.Diese Eigenschaft kann genutzt werden, um das Protein mit dem bekannten PI von anderen Proteinen in einer heterogenen Mischung zu trennen.Das andere Ende der Aminosäure ist das saure Carboxylterminal mit einem niedrigen pH -Wert.Bei unterschiedlichen pH -Werten variieren die Aminosäuren an den Proteinen in ihren Ladungen.Proteine unterhalb des isoelektrischen Punktes haben eine positive Ladung.Im Gegensatz dazu haben die oben genannten Punkte eine negative Ladung.

Um das Wissen über den isoelektrischen Punkt für die Proteinreinigung zu nutzen, wird ein Gemisch aus Proteinen einem elektrischen Feld ausgesetzt.Dies erfolgt häufig in Agarose- oder Polyacrylamidgelen und ist als isoelektrische Fokussierung bekannt.Eine ältere Technik besteht darin, das Verfahren auf einer größeren Skala in einer Glassäule mit einer Saccharose -Lösung mit Elektroden an jedem Ende durchzuführen.Verbindungen, die als Ampolyten bezeichnet werden, werden zugegeben, die die Bildung eines konsistenten pH -Gradienten verursachen.Wenn das Gel oder die Säule dem elektrischen Strom ausgesetzt ist, wandern die Proteine, bis sie ihren isoelektrischen Punkt erreichen, und bleiben dann stationär.

Proteine auf Gelen werden im Allgemeinen durch einen Farbstoff sichtbar gemacht, der Proteine bindet.Manchmal kann ein Substrat verwendet werden, wenn Enzyme untersucht werden, die eine farbige Reaktion ergibt.Normalerweise werden Standards verwendet, die Proteine von bekannten isoelektrischen Punkten aufweisen.

Sobald man weiß, wo sich das gewünschte Protein befindet, besteht eine gemeinsame Technik darin, das isolierte Protein aus dem Gel herauszuschneiden.Das Protein kann dann gereinigt und sequenziert werden.Sobald die Sequenz bekannt ist, kann sie verwendet werden, um Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu entwerfen und das Gen für das Protein zu klonen, wenn geeignetes Nukleinsäurematerial verfügbar ist.Verwandte Proteine, um zu sehen, wie unterschiedlich sie voneinander sind.Eine Komplikation kann sein, dass Proteine zu ihnen gebunden sind.Dies wird als Glykosylierung bezeichnet und kann den PI des Proteins beeinflussen.Es mag so aussehen, als ob es mehrere Proteine mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten gibt, obwohl es tatsächlich nur ein Protein gibt, das unterschiedlich glykosyliert wurde.Proteine, die durch Standardmethoden wie Chromatographie gereinigt werden, werden manchmal durch die isoelektrische Fokussierung analysiert, um ihre Reinheit zu gewährleisten.