Τι είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιεί ένζυμα για να αναπαράγει μάζα ένα τμήμα ενός κλώνου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) για ευκολότερη ανάλυση, όπως η αναζήτηση γονιδίων ενδιαφέροντος.Όπως και η πυρηνική αλυσιδωτή αντίδραση, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια εκθετική διαδικασία που προχωράει εφόσον είναι διαθέσιμες οι πρώτες ύλες για τη διατήρηση της αντίδρασης.Σε αντίθεση με την αντιγραφή του DNA στον φυσικό κόσμο, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μπορεί να αναπαράγει αρκετά μικρά κομμάτια DNA, με ανώτερη οροφή περίπου 2-3 κιλών ζεύγη βάσεων (KB).Μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιεί άψυχα ένζυμα για να επιτύχει την επίδρασή της αντιγραφής, καθορίζοντας το εκτός από άλλες προσεγγίσεις αντιγραφής που χρησιμοποιούν ενεργούς οργανισμούς.

Μια σύγχρονη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης απαιτεί έξι βασικά συστατικά για να λειτουργούν: το τμήμα DNA που πρέπει να αντιγραφεί, οι εκκινητές για να οριοθετήσουν τοΤμήμα, πολυμεράση TAQ για να κάνει την αντιγραφή, νουκλεοτίδια DNA για να χρησιμεύσει ως πρώτη ύλη, ένα χημικό περιβάλλον ρυθμιστικού και ένα μηχάνημα που ονομάζεται θερμικός κυκλοποιητής.Ο θερμικός κύκλος διατηρεί συχνά πολλαπλούς δοκιμαστικούς σωλήνες με πολλαπλές αλυσίδες πολυμεράσης, καθένα από τα οποία συγκρατεί 15 έως 100 μικολίτρα, τιμές ακριβώς κάτω από ένα κυβικό χιλιοστό νερού.Λειτουργεί καλά για την αντιγραφή, αλλά όχι τέλεια, κάνοντας ένα λάθος περίπου μία φορά κάθε 8 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων.Πριν από την πολυμεράση Taq, χρησιμοποιήθηκαν άλλες πολυμεράσες, αλλά πολλοί από αυτούς έσπασαν τις απαραίτητες θερμοκρασίες για την έναρξη της αντίδρασης.Ο κύκλος θέρμανσης είναι περίπλοκος, αλλά περιλαμβάνει θερμοκρασίες συνοπτικά που κυμαίνονται σχεδόν μέχρι το σημείο βρασμού, οπότε η ανθεκτικότητα στην πολυμεράση είναι απαραίτητη.Όλα τα συστατικά αναμειγνύονται μαζί σε ένα μικρό φιαλίδιο, συνήθως με όγκο 200 μικρογραμμάρια.Το μίγμα θερμαίνεται σε κοντά στο σημείο βρασμού για να σπάσει τους δεσμούς υδρογόνου στο ζευγάρι-στρογγυλό DNA, δημιουργώντας μεμονωμένα σκέλη που είναι ευαίσθητα στην αντιγραφή.Αυτό ονομάζεται

μετουσίωση

.Όσο μεγαλύτερη είναι η αντιγραφή του κλώνου, τόσο μεγαλύτερη είναι η διαδικασία μετουσιώσεως. Το επόμενο βήμα στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ονομάζεται

ανόπτηση

.Οι εκκινητές, οι οποίοι είναι προσαρμοσμένοι, βραχείς κλώνους DNA, σχεδιάζονται ειδικά για να δεσμεύονται με θέσεις στην αρχή και στο τέλος του τμήματος που πρέπει να αντιγραφούν.Εάν οι εκκινητές είναι λανθασμένα σχεδιασμένοι ή η θερμοκρασία σε αυτό το στάδιο είναι λάθος, ο εκκινητής θα δεσμεύεται τυχαία στο DNA, με αποτέλεσμα το λάθος αντίγραφο τμήματος.Οι περισσότεροι εκκινητές λιώνουν σε περίπου δύο τρίτα του δρόμου στο σημείο βρασμού και η ανόπτηση, μια διαδικασία 1-2 λεπτών, λαμβάνει χώρα σε λίγους βαθμούς κάτω από αυτό. Τα τελευταία βήματα στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ονομάζονται

Extension

και Τελική επέκταση .Αυτό είναι όπου συμβαίνει η μαγεία.Η πολυμεράση αντιγράφει γρήγορα το τμήμα DNA, δημιουργώντας εκατομμύρια και εκατομμύρια αντίτυπα σε απλά λεπτά.Συνήθως, ένας κύκλος αποτελείται από όλα τα προηγούμενα βήματα, που επαναλαμβάνεται περίπου είκοσι ή τριάντα φορές.

Το αποτέλεσμα είναι μια δέσμη αντιγραφής DNA.Οι αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης έχουν ποικίλες χρήσεις, συμπεριλαμβανομένης της δοκιμής πατρότητας, καθορίζοντας την παρουσία ή την απουσία γενετικού ελαττώματος ή ιικού DNA, κλωνοποίηση ενός γονιδίου, εισάγοντας συγκεκριμένες μεταλλάξεις, αναλύοντας το DNA των εξαφανισμένων ειδών ή των νεκρών, "γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα" στοΣκηνή εγκλήματος και πολλά άλλα.