Vad är den isoelektriska punkten?

Proteiner är byggda av kedjor av aminosyror, som var och en har olika pH -värden.Det totala pH för proteinet består av blandningen av pH -värdena för de enskilda aminosyrorna när de bildar joner i den speciella lösningen där de löses.Den isoelektriska punkten (PI) för ett protein är pH vid vilket det proteinet inte har någon nettoladdning.Den här egenskapen kan utnyttjas för att separera proteinet med de kända PI från andra proteiner i en heterogen blandning.

Aminosyror har en aminoterminalgrupp som är grundläggande, med ett högt pH.Den andra änden av aminosyran är karboxylterminalen som är sur, med lågt pH.Vid olika pH -värden kommer aminosyrorna på proteinerna att variera i deras laddningar.Proteiner under deras isoelektriska punkt har en positiv laddning.Däremot har de ovanför denna punkt en negativ laddning.

För att utnyttja kunskap om den isoelektriska punkten för proteinrening utsätts en blandning av proteiner för ett elektriskt fält.Detta görs vanligtvis i agaros- eller polyakrylamidgeler och är känt som isoelektrisk fokusering.En äldre teknik är att utföra proceduren i större skala i en glaskolonn med en lösning av sackaros med elektroder i varje ände.Föreningar som kallas amfolyter tillsätts som orsakar bildning av en konsekvent pH -gradient.När gelén eller kolonnen utsätts för den elektriska strömmen, migrerar proteinerna tills de når sin isoelektriska punkt och förblir sedan stationära.

Proteiner på geler syns vanligtvis av ett färgämne som binder proteiner.Ibland, om enzymer studeras, kan ett substrat användas som ger en färgad reaktion.Vanligtvis används standarder som har proteiner med kända isoelektriska punkter.

När man väl vet var det önskade proteinet är beläget är en vanlig teknik att skära det isolerade proteinet ur gelén.Proteinet kan sedan renas och sekvenseras.När sekvensen är känd kan den användas för att designa primrar för polymeraskedjereaktionen (PCR) och användas för att klona genen för proteinet om lämpligt nukleinsyrataterial är tillgängligt.

Isoelektrisk fokusering är också ett vanligt sätt att analysera nära näraRelaterade proteiner för att se hur olika de är från varandra.En komplikation kan vara att proteiner kan ha sockerarter bundna till dem.Detta kallas glykosylering och kan påverka proteinets PI.Det kan se ut som om det finns flera proteiner med olika isoelektriska punkter, när det faktiskt bara finns ett protein som har varit differentiellt glykosylerat.Proteiner som renas med standardmetoder såsom kromatografi analyseras ibland genom isoelektrisk fokusering för att säkerställa deras renhet.