Hvad er de forskellige metoder til bestemmelse af proteinkoncentration?
Der er hundreder af forskellige metoder til proteinkoncentrationsbestemmelse.Den utrolige mangfoldighed i de typer proteinopløsninger, som biokemister analyserer, er, hvorfor der ikke er nogen enkelt universel metode, der fungerer for enhver type proteinopløsning.De mest almindelige proteinassays er Bradford -assayet, Lowry -assayet og bicinchoninsyreassayet.Ikke desto mindre er der udviklet utallige variationer efter behov for at arbejde omkring enhver potentiel kemisk uforenelighed mellem proteinkyllingen og reagenserne, der anvendes i assayet.
Generelt er der to hovedkategorier af assays til proteinkoncentrationsbestemmelse.I den første gruppe af metoder tilsættes et farverigt eller fluorescerende farvestof til en proteinopløsning, og den binder specifikt til protein.Det bundne farvestof har en unik absorptionsbølgelængde, der er proportional med mængden af protein.Ved at bruge et spektrometer bliver det muligt at estimere koncentrationen af protein.
Den anden gruppe af assays involverer tilsætning af kobber (II) -ioner til en opløsning af protein, hvor disse ioner reduceres til kobber (I) ioner.Disse reducerede ioner er derefter i stand til at danne farverige komplekser ved binding til proteiner.Ved at måle absorbanserne ved deres unikke bølgelængder kan proteinkoncentrationerne ligeledes udledes.
En af de mest populære metoder til proteinkoncentrationsbestemmelse er Bradford -assayet.I dette assay føjes et rødt farvestof kaldet Coomassie strålende blå til en proteinopløsning under sure forhold.Når dette farvestof binder til protein, danner det et permanent blåt kompleks med en karakteristisk absorbans ved 595 nanometer.
På trods af den generelle alsidighed af Bradford -assayet er det uforeneligt med nogle proteinopløsninger.Især forstyrres Bradford -assayet af tilstedeværelsen af natriumdodecylsulfat (SDS), et vaskemiddel, der ofte bruges til at rense proteiner og nedbryde celler ved lysering.Dette vaskemiddel forstyrrer bindingen af farvestoffet til proteiner, hvilket resulterer i en upålidelig og unøjagtig absorptionslæsning.Andre typer metoder skal derefter anvendes, når SDS er til stede.
Der er udviklet en anden række proteinassays, og de involverer alle en variation af Biuret -testen.I denne reaktion kombineres et protein med en vandig base og kobber (II) -ioner.Disse ioner reduceres og cheleres derefter af protein til dannelse af farverige komplekser.To assays, der bruger denne test, er Lowry-assayet, og bicinchoninsyreassayet.
Med Lowry-assayet tilsættes en folin-ciocalteu-reagens til Biuret-testen.Folin-ciocalteu-reagensen oxideres aromatiske rester, især tryptophan, og hjælper kompleksen med at absorbere stærkt ved 750 nanometre.Bicinchoninsyreassayet involverer på den anden side tilsætning af bicinchoninsyre til biuret -testen.Efter en kort inkubation ved ca. 104 DEG;Fahrenheit (40 deg; celsius), to ækvivalenter af syre og peptidbindingerne af proteinet chelat et enkelt kobber (I) ion.Resultatet er et kompleks, der absorberer stærkt ved 562 nanometre.
Når man vælger en metode til proteinkoncentrationsbestemmelse, er det vigtigt for en at overveje de forskellige kemiske funktionelle grupper, der er til stede i opløsningen.Tilstedeværelsen af visse aminosyresidekæder, disulfidbindinger og kofaktorer kan gøre proteinkoncentrationsbestemmelsen vildt unøjagtige.Det er ofte nødvendigt for en at ikke kun overveje proteinerne, men også andre reagenser og buffere, såsom reduktion af midler og vaskemidler.Den ideelle metode vil være kemisk kompatibel såvel som pålidelig, billig og enkel at konfigurere.