Was sind die verschiedenen Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration?
Es gibt Hunderte verschiedener Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration.Die unglaubliche Vielfalt in den Arten von Proteinlösungen, die Biochemiker analysieren, ist, warum es keine einzige universelle Methode gibt, die für jede Art von Proteinlösung funktioniert.Die häufigsten Protein -Assays sind der Bradford -Assay, der Lowry -Assay und der Bicinchoninsäure -Assay.Trotzdem wurden unzählige Variationen entwickelt, um potenzielle chemische Inkompatibilitäten zwischen der Proteinlösung und den im Assay verwendeten Reagenzien zu verarbeiten.
Im Allgemeinen gibt es zwei Hauptkategorien von Assays für die Bestimmung der Proteinkonzentration.In der ersten Gruppe von Methoden wird zu einer Proteinlösung ein farbenfroher oder fluoreszierender Farbstoff zugesetzt und bindet spezifisch an Protein.Der gebundene Farbstoff hat eine einzigartige Absorptionswellenlänge, die proportional zur Proteinmenge ist.Durch die Verwendung eines Spektrometers wird es möglich, die Proteinkonzentration abzuschätzen.
Die zweite Gruppe von Assays beinhaltet die Zugabe von Kupfer (ii) Ionen zu einer Proteinlösung, bei der diese Ionen auf Kupfer (i) -Ionen reduziert werden.Diese reduzierten Ionen können dann bunte Komplexe bilden, indem sie an Proteine binden.Durch Messen der Absorptionen bei ihren einzigartigen Wellenlängen können auch die Proteinkonzentrationen abgeleitet werden.
Eine der beliebtesten Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist der Bradford -Assay.In diesem Assay wird ein roter Farbstoff namens Coomassie Brilliant Blue zu einer Proteinlösung unter sauren Bedingungen zugesetzt.Da dieser Farbstoff an Protein bindet, bildet es einen permanenten blauen Komplex mit einer charakteristischen Absorption bei 595 Nanometern.
Trotz der allgemeinen Vielseitigkeit des Bradford -Assays ist er mit einigen Proteinlösungen unvereinbar.Insbesondere der Bradford -Assay wird durch das Vorhandensein von Natriumdodecylsulfat (SDS) gestört, einem Reinigungsmittel, das üblicherweise zum Reinigen von Proteinen und zum Aufbrechen von Zellen durch Lyse verwendet wird.Dieses Reinigungsmittel stört die Bindung des Farbstoffs an Proteine, was zu einem unzuverlässigen und ungenauen Absorptionswert führt.Andere Arten von Methoden müssen also verwendet werden, wenn SDS vorhanden ist.
Es wurde eine andere Reihe von Protein -Assays entwickelt, und alle beinhalten eine Variation des Biurettentests.In dieser Reaktion wird ein Protein mit einer wässrigen Basis und Kupfer (II) -Ionen kombiniert.Diese Ionen werden reduziert und dann durch Protein chelziert, um farbenfrohe Komplexe zu bilden.Zwei Assays, die diesen Test verwenden, sind der Lowry-Assay und der Bicinchoninsäure-Assay.
Mit dem Lowry-Assay wird dem Biurett-Test ein Folin-CiocalTeu-Reagenz hinzugefügt.Das Folin-Ciocalteeu-Reagenzs oxidiert aromatische Reste, insbesondere Tryptophan, und hilft dem Komplex, bei 750 Nanometern stark absorbiert zu werden.Der Bicinchoninsäure -Assay dagegen beinhaltet die Zugabe von Bicinchoninsäure zum Biurettentest.Nach einer kurzen Inkubation bei ca. 104 deg;Fahrenheit (40 Grad; Celsius), zwei Äquivalente von Säure und die Peptidbindungen des Proteins chelat ein einzelnes Kupfer (I) -Ion.Das Ergebnis ist ein Komplex, der bei 562 Nanometern stark absorbiert.
Bei der Auswahl einer Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist es wichtig, dass man die verschiedenen in der Lösung vorhandenen chemischen funktionellen Gruppen berücksichtigt.Das Vorhandensein bestimmter Aminosäureseitenketten, Disulfidbindungen und Cofaktoren kann die Bestimmung der Proteinkonzentration wild ungenau machen.Es ist oft notwendig, dass man nicht nur die Proteine, sondern auch andere Reagenzien und Puffer berücksichtigt, wie z. B. Reduktionsmittel und Reinigungsmittel.Die ideale Methode ist chemisch kompatibel und zuverlässig, billig und einfach eingerichtet.