Cosa sta rilevando ELISA?
Un test immunosorbente collegato all'enzima (ELISA) è un test eseguito in un laboratorio di immunologia per determinare i livelli di proteina in un campione biologico.Il rilevamento di ELISA si riferisce alla fase finale del test in cui una soluzione chiara, o substrato, viene aggiunta a una piastra di plastica contenente anticorpo marcato con enzimi legati.L'enzima scinde il substrato e si verifica un cambiamento di colore.L'assorbanza della luce della soluzione colorata finale viene quindi misurata su un lettore o spettrofotometro a piastre ELISA.
Esistono vari tipi di test ELISA, con i due più comuni sono l'Elisa indiretto e la cattura o il sandwich, ELISA.L'ELISA indiretto viene utilizzato per rilevare una proteina, nota come anticorpo, nel siero di un paziente.Un esempio di test ELISA indiretto è il test del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) utilizzato per rilevare gli anticorpi contro l'HIV.Il test ELISA di Sandwich rileva una proteina o l'antigene, catturandolo tra due anticorpi.Il rilevamento dell'ormone gonadotropina corionica umana (HCG), che è elevato durante la gravidanza, viene eseguito con un test ELISA sandwich.
Entrambi i test hanno un passaggio di rilevamento ELISA alla fine del test.Questo passaggio prevede l'aggiunta di un anticorpo che ha una molecola enzimatica attaccata ad esso.Dopo l'aggiunta dell'anticorpo marcato con enzimi, viene aggiunta una soluzione incolore, contenente la molecola di substrato specifica per quell'enzima.L'enzima divide la molecola del substrato e la soluzione cambia il colore a seconda della combinazione utilizzata.Determinazione della quantità di anticorpo o antigene nel campione del paziente viene eseguita misurando l'intensità della variazione del colore.
Esistono diverse combinazioni di substrato enzimatico disponibili per l'uso nella fase di rilevamento ELISA.L'enzima più comune è la perossidasi di rafano (HRP), che può scindere le molecole del substrato orto-fenilendiammina diidrocloruro (OPD) e tetrametilbenzidina (TMB), tra gli altri.La scissione di OPD e TMB provoca un colore giallo e la densità ottica o l'assorbanza della luce di questi substrati è misurata da un lettore di piastre ELISA.L'assorbanza della luce dell'OPD viene misurata a una lunghezza d'onda di 490 nanometri (NM) mentre la TMB viene misurata a 450 nm.
Un altro enzima comune usato nella fase di rilevamento ELISA è la fosfatasi alcalina.Questo enzima viene utilizzato con il substrato P-nitrofenil fosfato (PNPP) e produce anche una soluzione gialla.PNPP assorbe la luce a una lunghezza d'onda di 405 nm.
La selezione delle combinazioni di substrato enzimatico si basa di solito su quali anticorpi marcati con enzimi sono disponibili in commercio, nonché quali attrezzature verranno utilizzate per misurare l'assorbimento della luce.Le numerose combinazioni disponibili per il rilevamento ELISA rendono il test ELISA altamente versatile.È uno strumento importante nei laboratori di test e ricerca della malattia.