Wat is Shotgun -sequencing?

Shotgun-sequencing is een methode voor DNA-sequencing waarbij een lang stuk DNA fysiek wordt onderverdeeld in kleine (ongeveer 2.000 basispaar) fragmenten die worden gekloneerd, gesequentieerd en geassembleerd met behulp van computeranalyse.Het werd ontwikkeld en beroemd gemaakt door Craig Venter van Celera Corporation.Venter ontwikkelde de techniek in 1996 terwijl hij werkte bij het Institute for Genome Research.

Venter richtte Celera in 1998 op met de missie van het sequencen van het menselijke genoom binnen drie jaar.Dit doel was in directe concurrentie met het reeds opererende Human Genome Project, een consortium van universiteiten die samenwerken om het menselijke genoom te sequencen met behulp van een oudere strategie genaamd MAP-gebaseerde of BAC-BAC-sequencing.Deze methode omvatte het eerst het breken van het genoom in 150.000 basenpaarstukken genaamd BAC's, de BAC's in volgorde samenstellen en vervolgens elke BAC in detail sequencen.

Hele genoom shotgun sequencing omzeilt het maken en mapping van BAC's en begint meteen met DNA -sequencing.Het proces begint met het verkrijgen van een monster van hoog molecuulgewicht -DNA uit het interessante organisme en het fysiek in kleine stukjes breken door het door een smalspuit te geven of te soniceren, een manier om het monster te breken met geluidsgolven.Shearing is een willekeurig proces, dus de sequenties van de fragmenten zullen er tussen staan.Shearing creëert niet specifiek de 2.000 basenparenfragmenten die nodig zijn voor sequencing, eerder fragmenten van de gewenste grootte moeten worden gezuiverd uit het mengsel.

De volgende stap is om deel te nemen aan de DNA -fragmenten met dragers -DNA dat een vector wordt genoemd.Dit proces staat bekend als klonen en creëert een sequencing -bibliotheek waaruit de volgorde van een heel genoom zal worden gecreëerd.De volgorde van elke kloon in de bibliotheek wordt bepaald en computeranalyse wordt gebruikt om overlappende of continue sequenties in elk fragment te vinden.Het assembleren van de overlappingen creëert een "contig", wat een lang continu stuk DNA -sequentie is.

Shotgun -klonen resulteert meestal in enkele openingen tussen contigs omdat sommige sequenties toevallig in de bibliotheek ontbreken.Hiaten kunnen worden opgevuld door een nieuwe bibliotheek te maken of door bekende sequenties te gebruiken om zich naar buiten uit te breiden vanaf de contig.Omdat shotgun sequenties sequenties willekeurig DNA -fragmenten, veel fragmenten meer dan eens worden gesequenced, waardoor meer zekerheid ontstaat dat de sequentie correct is dan als elk fragment slechts een of twee keer gesequenced was.

Het menselijke genoom werd zowel door het menselijke genoomproject dat door het menselijke genoomproject werd gesequenced wasmet behulp van op kaart gebaseerde sequencing en door Celera met behulp van shotgun-sequencing.Shotgun -sequencing is nu de voorkeursmethode voor andere soorten genoomsequencing.De volledige genomen van vele organismen, zoals de plant Arabidopsis thaliana , rijst, de koe, hond, kip, chimpansee, rat, muis, puffervis en veel micro -organismen zijn op deze manier gesequenced.