Jak określa się poziom fosforylacji?

Poziom fosforylacji cząsteczek organicznych lub substancji jest określany dwiema metodami: Western blotting i spektrometria mas.Fosforylacja najczęściej odnosi się do przyłączenia fosforanu do białka.Gdy fosforany przyczepną do protienów, zakłócone są naturalne procesy i funkcje enzymów białkowych w ciele ludzkim.Określenie poziomu fosforylacji ma kluczowe znaczenie dla leczenia szerokiego zakresu chorób, od raka po cukrzycę.

Western blotting jest popularną metodą stosowaną do określenia poziomu fosforylacji określonego zestawu białek.Przeciwciała, takie jak antyfosfo-tyrozynowe przeciwciała monoklonalne, są zwykle stosowane, ponieważ łatwo wiążą się z resztami tyrozynami białkami, na które wpływają fosforylacja.W Western Blotting białka najpierw oddzielane są wielkością przy użyciu metody ładunku elektrycznego znanej jako elektroforeza żelowa.

Białka są następnie przenoszone na błonę, która została pokryta specjalnymi przeciwciałami, które wiążą się z fosforanami na białkach.Po przeniesieniu białek przeciwciała przyklejają się do dowolnego białka z przyłączonym fosforanem.Poziom fosforylacji można następnie określić za pomocą promieniowania błony.Wszelkie dotknięte białka wydzielają błysk światła, co ułatwia badaczowi pomiar poziomów fosforylacji.

Spektrometria mas jest kolejnym sposobem pomiaru poziomu fosforylacji substancji.Ten proces przekształca cząsteczki białka w jony, co ułatwia je śledzeniem i pomiarem.Próbka jest jonizowana przez źródło jonowe o dużej mocy, które utrudnia próbkę elektronami.To działanie zamienia próbkę w kationów, dodatnie naładowane jony.

Analizator masowy spektrometru mas oddziela jony na ich masie i intensywność ładunku.Pozwala to badaczowi odkryć stosunek masy do ładowania, co ma kluczowe znaczenie w odkryciu poziomu fosforylacji próbki.Wreszcie, detektor mierzy jony, aby dane mogły być wyświetlane w formie wykresu.Wykres pokazuje stosunek masy do ładowania jonów na osi X oraz względną intensywność jonów na osi Y.

Poziomy fosforylacji można również mierzyć podczas fosforylacji substratu.Fosforylacja substratu jest procesem, który tworzy trifosforan adenozyny (ATP), cząsteczkę krytyczną dla transferu energii między komórek, podczas glikolizy.Proces ten występuje zarówno w komórkach zwierzęcych, jak i komórkach roślinnych.

W komórkach roślinnych cząsteczki ATP powstają przy użyciu energii ze słońca.Energia ta pobudza fosforylację w roślinach chloroplastów, miejsca fotosyntezy roślin.Poziom fosforylacji koreluje z ilością fosforanu potrzebnego do stworzenia dodatkowych cząsteczek ATP.