Jak określa się poziom fosforylacji?

Poziom fosforylacji cząsteczek organicznych lub substancji jest określany dwiema metodami: Western blotting i spektrometria mas. Fosforylacja najczęściej odnosi się do przyłączenia fosforanu do białka. Gdy fosforany przyczepną do protienów, zakłócone są naturalne procesy i funkcje enzymów białkowych w ciele ludzkim. Określenie poziomu fosforylacji ma kluczowe znaczenie dla leczenia szerokiego zakresu chorób, od raka po cukrzycę.

Western blotting jest popularną metodą stosowaną do określenia poziomu fosforylacji określonego zestawu białek. Zwykle stosowane są przeciwciała, takie jak antyfosfo-tyrozynowe przeciwciała monoklonalne, ponieważ łatwo wiążą się z resztami tyrozyny białka, na które wpływają fosforylacja. W Western blot białka najpierw oddzielane są wielkością przy użyciu metody ładowania elektrycznego znanego jako elektroforeza żelowa.

Białka są następnie przenoszone na błonę, która została pokryta specjalnymi przeciwciałami, które wiążą się z fosfatemES na białkach. Po przeniesieniu białek przeciwciała przyklejają się do dowolnego białka z przyłączonym fosforanem. Poziom fosforylacji można następnie określić za pomocą promieniowania błony. Wszelkie dotknięte białka wydzielają błysk światła, co ułatwia badaczowi pomiar poziomów fosforylacji.

Spektrometria mas jest innym sposobem pomiaru poziomu fosforylacji substancji. Ten proces przekształca cząsteczki białka w jony, co ułatwia je śledzeniem i pomiarem. Próbka jest jonizowana przez źródło jonowe o dużej mocy, które utrudnia próbkę elektronami. To działanie zamienia próbkę w kationów, dodatnie naładowane jony.

Analizator masowy spektrometru mas oddziela jony na ich masie i intensywność ładunku. To pozwala badaczowi odkryć współczynnik masy do ładunku, co ma kluczowe znaczenie w odkryciu poziomu fosforylacjipróbki. Wreszcie, detektor mierzy jony, aby dane mogły być wyświetlane w formie wykresu. Wykres pokazuje stosunek masy do ładowania jonów na osi X oraz względną intensywność jonów na osi Y.

Poziomy fosforylacji można również mierzyć podczas fosforylacji substratu. Fosforylacja substratu jest procesem, który tworzy trifosforan adenozyny (ATP), cząsteczkę krytyczną dla transferu energii między komórek, podczas glikolizy. Proces ten występuje zarówno w komórkach zwierzęcych, jak i komórkach roślinnych.

W komórkach roślinnych cząsteczki ATP są tworzone przy użyciu energii ze słońca. Energia ta pobudza fosforylację w chloroplastach rośliny, miejsca fotosyntezy roślin. Poziom fosforylacji koreluje z ilością fosforanu potrzebnego do stworzenia dodatkowych cząsteczek ATP.