Ποιο είναι το ισοηλεκτρικό σημείο;

Οι πρωτεΐνες είναι χτισμένες από αλυσίδες αμινοξέων, καθένα από τα οποία έχουν διαφορετικές τιμές ρΗ.Το συνολικό ρΗ της πρωτεΐνης αποτελείται από το μίγμα των τιμών ρΗ των μεμονωμένων αμινοξέων καθώς σχηματίζουν ιόντα στο συγκεκριμένο διάλυμα στο οποίο διαλύονται.Το ισοηλεκτρικό σημείο (ΡΙ) μιας πρωτεΐνης είναι το ρΗ στο οποίο η πρωτεΐνη αυτή δεν έχει καθαρή φόρτιση.Αυτή η ιδιότητα μπορεί να εκμεταλλευτεί για να διαχωρίσει την πρωτεΐνη με το γνωστό ΡΙ από άλλες πρωτεΐνες σε ένα ετερογενές μίγμα. Τα αμινοξέα έχουν μια αμινο -τερματική ομάδα που είναι βασική, έχοντας υψηλό ρΗ.Το άλλο άκρο του αμινοξύ είναι το καρβοξυλικό τερματικό που είναι όξινο, με χαμηλό pH.Σε διαφορετικές τιμές ρΗ, τα αμινοξέα στις πρωτεΐνες θα διαφέρουν στις χρεώσεις τους.Οι πρωτεΐνες κάτω από το ισοηλεκτρικό τους σημείο έχουν θετικό φορτίο.Αντίθετα, τα πάνω από αυτό το σημείο έχουν αρνητική χρέωση.

Για να εκμεταλλευτεί τη γνώση του ισοηλεκτρικού σημείου για τον καθαρισμό πρωτεΐνης, ένα μίγμα πρωτεϊνών υπόκειται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο.Αυτό γίνεται συνήθως σε πηκτές αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου και είναι γνωστό ως ισοηλεκτρική εστίαση.Μια παλαιότερη τεχνική είναι η εκτέλεση της διαδικασίας σε μεγαλύτερη κλίμακα σε μια γυάλινη στήλη χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα σακχαρόζης με ηλεκτρόδια σε κάθε άκρο.Προστίθενται ενώσεις που ονομάζονται αμφόλυτα που προκαλούν το σχηματισμό μιας σταθερής κλίσης ρΗ.Όταν το πήκτωμα ή η στήλη υποβάλλονται στο ηλεκτρικό ρεύμα, οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν μέχρι να φτάσουν στο ισοηλεκτρικό τους σημείο και στη συνέχεια να παραμένουν ακίνητες. Οι πρωτεΐνες σε πηκτές είναι γενικά ορατές από μια βαφή που δεσμεύει τις πρωτεΐνες.Μερικές φορές, εάν μελετηθούν τα ένζυμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα υπόστρωμα που δίνει μια έγχρωμη αντίδραση.Συνήθως χρησιμοποιούνται πρότυπα που έχουν πρωτεΐνες γνωστών ισοηλεκτρικών σημείων.

Μόλις γνωρίζει κανείς πού βρίσκεται η επιθυμητή πρωτεΐνη, μια κοινή τεχνική είναι να μειώσει την απομονωμένη πρωτεΐνη από το πήκτωμα.Η πρωτεΐνη μπορεί στη συνέχεια να καθαριστεί και να προσβληθεί από την αλληλουχία.Σχετικές πρωτεΐνες για να δουν πόσο διαφορετικά είναι μεταξύ τους.Μια επιπλοκή μπορεί να είναι ότι οι πρωτεΐνες μπορούν να έχουν σάκχαρα δεσμευμένα σε αυτά.Αυτό ονομάζεται γλυκοζυλίωση και μπορεί να επηρεάσει το PI της πρωτεΐνης.Μπορεί να φαίνεται ότι υπάρχουν πολλαπλές πρωτεΐνες με διαφορετικά ισοηλεκτρικά σημεία, όταν στην πραγματικότητα υπάρχει μόνο μία πρωτεΐνη που έχει διαφορικά γλυκοζυλιωμένη.Οι πρωτεΐνες που καθαρίζονται με τυποποιημένες μεθόδους όπως η χρωματογραφία αναλύονται μερικές φορές με ισοηλεκτρική εστίαση για να εξασφαλιστεί η καθαρότητά τους.