Ποιες είναι οι διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών;

Υπάρχουν εκατοντάδες διαφορετικές μεθόδους προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών.Η απίστευτη ποικιλομορφία στους τύπους διαλυμάτων πρωτεϊνών που αναλύουν οι βιοχημικοί είναι ο λόγος για τον οποίο δεν υπάρχει ενιαία καθολική μέθοδος που να λειτουργεί για κάθε τύπο διαλύματος πρωτεϊνών.Οι πιο συνηθισμένες δοκιμασίες πρωτεΐνης είναι η δοκιμασία Bradford, ο προσδιορισμός Lowry και η δοκιμασία διικινινικού οξέος.Παρ 'όλα αυτά, έχουν αναπτυχθεί μυριάδες παραλλαγές, όπως απαιτείται για να εργαστούν γύρω από πιθανές χημικές ασυμβατότητες μεταξύ του πρωτεϊνικού διαλύματος και των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται στον προσδιορισμό.Στην πρώτη ομάδα μεθόδων, μια πολύχρωμη ή φθορίζουσα βαφή προστίθεται σε ένα πρωτεϊνικό διάλυμα και δεσμεύεται ειδικά με πρωτεΐνες.Η δεσμευμένη βαφή έχει ένα μοναδικό μήκος κύματος απορρόφησης που είναι ανάλογο με την ποσότητα πρωτεΐνης.Χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο, είναι δυνατόν να εκτιμηθεί η συγκέντρωση της πρωτεΐνης.

Η δεύτερη ομάδα προσδιορισμών περιλαμβάνει την προσθήκη ιόντων χαλκού (II) σε ένα διάλυμα πρωτεΐνης, όπου αυτά τα ιόντα μειώνονται σε ιόντα χαλκού (Ι).Αυτά τα μειωμένα ιόντα είναι στη συνέχεια σε θέση να σχηματίσουν πολύχρωμα σύμπλοκα με δέσμευση σε πρωτεΐνες.Με τη μέτρηση των απορροφήσεων στα μοναδικά μήκη κύματος τους, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μπορούν επίσης να συναχθούν.

Μια από τις πιο δημοφιλείς μεθόδους προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεΐνης είναι η δοκιμασία Bradford.Σε αυτή τη δοκιμασία, μια κόκκινη βαφή που ονομάζεται Coomassie Brilliant Blue προστίθεται σε ένα πρωτεϊνικό διάλυμα υπό όξινες συνθήκες.Καθώς αυτή η βαφή συνδέεται με την πρωτεΐνη, σχηματίζει ένα μόνιμο μπλε σύμπλεγμα με χαρακτηριστική απορρόφηση στα 595 νανόμετρα.Συγκεκριμένα, ο προσδιορισμός του Bradford διαταράσσεται από την παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS), ένα απορρυπαντικό που χρησιμοποιείται συνήθως για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών και τη διάσπαση των κυττάρων με λύση.Αυτό το απορρυπαντικό παρεμβαίνει στη δέσμευση της βαφής σε πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα μια αναξιόπιστη και ανακριβή ανάγνωση απορρόφησης.Επομένως, πρέπει να χρησιμοποιηθούν άλλοι τύποι μεθόδων όταν υπάρχει SDS. Έχει αναπτυχθεί μια άλλη σειρά προσδιορισμών πρωτεϊνών και όλα περιλαμβάνουν μια παραλλαγή της δοκιμής Biuret.Σε αυτή την αντίδραση, μια πρωτεΐνη συνδυάζεται με μια υδατική βάση και τα ιόντα χαλκού (II).Αυτά τα ιόντα μειώνονται και στη συνέχεια χηλίζονται από πρωτεΐνες για να σχηματίσουν πολύχρωμα σύμπλοκα.Δύο δοκιμασίες που χρησιμοποιούν αυτή τη δοκιμή είναι η δοκιμασία Lowry και η δοκιμασία διικονινικού οξέος.Το αντιδραστήριο folin-ciocalteu οξειδώνει τα αρωματικά υπολείμματα, ιδιαίτερα τη τρυπτοφάνη, και βοηθά το σύνθετο να απορροφήσει έντονα στα 750 νανόμετρα.Η δοκιμασία διικινινικού οξέος, από την άλλη πλευρά, περιλαμβάνει την προσθήκη διικινινικού οξέος στη δοκιμή Biuret.Μετά από μια σύντομη επώαση σε περίπου 104 deg.Fahrenheit (40 deg, Κελσίου), δύο ισοδύναμα οξέος και των πεπτιδίων δεσμών του πρωτεϊνικού χηλικού ιόντος ενός μόνο χαλκού (Ι).Το αποτέλεσμα είναι ένα σύμπλεγμα που απορροφά έντονα στα 562 νανομετρικά.Η παρουσία ορισμένων πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων, δισουλφιδικών δεσμών και συμπαράγων μπορεί να κάνει τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης άγρια ανακριβής.Είναι συχνά απαραίτητο για κάποιον να εξετάσει όχι μόνο τις πρωτεΐνες αλλά και άλλα αντιδραστήρια και ρυθμιστικά, όπως μειώνοντας τους παράγοντες και τα απορρυπαντικά.Η ιδανική μέθοδος θα είναι χημικά συμβατή καθώς και αξιόπιστη, φθηνή και απλή για τη δημιουργία.