Các phương pháp xác định nồng độ protein khác nhau là gì?

Có hàng trăm phương pháp xác định nồng độ protein khác nhau.Sự đa dạng đáng kinh ngạc trong các loại giải pháp protein mà các nhà hóa sinh phân tích là lý do tại sao không có phương pháp phổ quát nào hoạt động cho mọi loại giải pháp protein.Các xét nghiệm protein phổ biến nhất là xét nghiệm của Bradford, xét nghiệm Lowry và xét nghiệm axit bicinchoninic.Tuy nhiên, vô số biến thể đã được phát triển khi cần thiết để làm việc xung quanh bất kỳ khả năng tương thích hóa học tiềm năng nào giữa dung dịch protein và thuốc thử đang được sử dụng trong xét nghiệm. Nói chung, có hai loại xét nghiệm chính để xác định nồng độ protein.Trong nhóm phương pháp đầu tiên, thuốc nhuộm đầy màu sắc hoặc huỳnh quang được thêm vào dung dịch protein và nó liên kết đặc biệt với protein.Thuốc nhuộm liên kết có bước sóng hấp thụ duy nhất tỷ lệ thuận với lượng protein.Bằng cách sử dụng máy quang phổ, có thể ước tính nồng độ protein.Nhóm xét nghiệm thứ hai liên quan đến việc thêm các ion đồng (II) vào dung dịch protein, trong đó các ion này được giảm xuống thành các ion đồng (I).Các ion giảm này sau đó có thể tạo thành các phức chất đầy màu sắc bằng cách liên kết với protein.Bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng độc đáo của chúng, nồng độ protein cũng có thể được suy ra. Một trong những phương pháp phổ biến nhất về xác định nồng độ protein là xét nghiệm của Bradford.Trong xét nghiệm này, một loại thuốc nhuộm màu đỏ có tên Coomassie Brilliant Blue được thêm vào dung dịch protein trong điều kiện axit.Vì thuốc nhuộm này liên kết với protein, nó tạo thành một phức hợp màu xanh vĩnh viễn với độ hấp thụ đặc trưng ở 595 nanomet. Mặc dù tính linh hoạt chung của xét nghiệm Bradford, nó không tương thích với một số dung dịch protein.Cụ thể, xét nghiệm của Bradford bị phá vỡ bởi sự hiện diện của natri dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy rửa thường được sử dụng để tinh chế protein và phá vỡ các tế bào bằng cách ly giải.Chất tẩy rửa này can thiệp vào sự gắn kết của thuốc nhuộm với protein, dẫn đến việc đọc hấp thụ không đáng tin cậy và không chính xác.Sau đó, các loại phương pháp khác phải được sử dụng khi có SDS.Trong phản ứng này, một protein được kết hợp với một cơ sở nước và các ion đồng (II).Các ion này được giảm và sau đó được chelated bởi protein để tạo thành các phức hợp đầy màu sắc.Hai xét nghiệm sử dụng thử nghiệm này là xét nghiệm Lowry và xét nghiệm axit bicinchoninic. Với xét nghiệm Lowry, một thuốc thử folin-ciocalteu được thêm vào thử nghiệm biuret.Thuốc thử folin-ciocalteu oxy hóa dư lượng thơm, đặc biệt là tryptophan và giúp phức tạp hấp thụ mạnh ở 750 nanomet.Mặt khác, xét nghiệm axit bicinchoninic liên quan đến việc thêm axit bicinchoninic vào thử nghiệm biuret.Sau một thời gian ngắn ủ ở khoảng 104 deg;F.Kết quả là một phức hợp hấp thụ mạnh ở 562 nanomet. Khi chọn phương pháp xác định nồng độ protein, điều quan trọng là người ta phải xem xét các nhóm chức năng hóa học khác nhau có trong dung dịch.Sự hiện diện của một số chuỗi bên axit amin, liên kết disulfide và đồng yếu tố có thể làm cho việc xác định nồng độ protein không chính xác.Người ta thường cần phải xem xét không chỉ các protein mà cả các thuốc thử và bộ đệm khác, chẳng hạn như giảm tác nhân và chất tẩy rửa.Phương pháp lý tưởng sẽ tương thích về mặt hóa học cũng như đáng tin cậy, rẻ và đơn giản để thiết lập.