วิธีการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนที่แตกต่างกันคืออะไร?

มีวิธีการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนหลายร้อยวิธีความหลากหลายที่น่าเหลือเชื่อในประเภทของโซลูชันโปรตีนที่นักชีวเคมีวิเคราะห์คือสาเหตุที่ไม่มีวิธีสากลเดียวที่ใช้งานได้สำหรับโซลูชันโปรตีนทุกประเภทการทดสอบโปรตีนที่พบบ่อยที่สุดคือการทดสอบของแบรดฟอร์ดการทดสอบ Lowry และการทดสอบกรด bicinchoninicอย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงมากมายได้รับการพัฒนาตามความจำเป็นในการแก้ไขความไม่ลงรอยกันทางเคมีที่อาจเกิดขึ้นระหว่างสารละลายโปรตีนและรีเอเจนต์ที่ใช้ในการทดสอบ

การพูดโดยทั่วไปมีการทดสอบหลักสองประเภทสำหรับการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนในกลุ่มแรกของวิธีการสีย้อมที่มีสีสันหรือฟลูออเรสเซนต์จะถูกเพิ่มเข้าไปในสารละลายโปรตีนและผูกกับโปรตีนโดยเฉพาะสีย้อมที่ถูกผูกไว้มีความยาวคลื่นการดูดซับที่เป็นเอกลักษณ์ซึ่งเป็นสัดส่วนกับปริมาณโปรตีนโดยการใช้สเปกโตรมิเตอร์จะเป็นไปได้ที่จะประเมินความเข้มข้นของโปรตีน

กลุ่มที่สองของการทดสอบเกี่ยวข้องกับการเพิ่มทองแดง (II) ไอออนลงในการแก้ปัญหาของโปรตีนซึ่งไอออนเหล่านี้จะลดลงเป็นไอออนทองแดง (i) ไอออนไอออนที่ลดลงเหล่านี้สามารถสร้างคอมเพล็กซ์ที่มีสีสันโดยการจับกับโปรตีนด้วยการวัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นที่เป็นเอกลักษณ์ของพวกเขาความเข้มข้นของโปรตีนสามารถอนุมานได้เช่นกัน

หนึ่งในวิธีการที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนคือการทดสอบแบรดฟอร์ดในการทดสอบนี้สีย้อมสีแดงที่เรียกว่า Coomassie Brilliant Blue จะถูกเพิ่มเข้าไปในสารละลายโปรตีนภายใต้สภาวะที่เป็นกรดเมื่อสีย้อมนี้จับกับโปรตีนมันจะสร้างคอมเพล็กซ์สีน้ำเงินถาวรด้วยการดูดกลืนแสงที่ 595 นาโนเมตร

แม้จะมีความสามารถรอบตัวทั่วไปของการทดสอบแบรดฟอร์ดมันก็เข้ากันไม่ได้กับโซลูชั่นโปรตีนบางอย่างโดยเฉพาะอย่างยิ่งการทดสอบแบรดฟอร์ดถูกรบกวนโดยการปรากฏตัวของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ซึ่งเป็นผงซักฟอกที่ใช้กันทั่วไปในการชำระล้างโปรตีนและทำลายเซลล์โดยการสลายผงซักฟอกนี้รบกวนการเชื่อมของสีย้อมกับโปรตีนซึ่งส่งผลให้การอ่านการดูดซับที่ไม่น่าเชื่อถือและไม่ถูกต้องจากนั้นจะต้องใช้วิธีการประเภทอื่น ๆ เมื่อมีการพัฒนา SDS

ชุดการตรวจโปรตีนอีกชุดหนึ่งได้รับการพัฒนาและพวกเขาทั้งหมดเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของการทดสอบ Biuretในปฏิกิริยานี้โปรตีนจะถูกรวมเข้ากับฐานน้ำและไอออนทองแดง (II) ไอออนไอออนเหล่านี้จะลดลงและจากนั้นก็ chelated โดยโปรตีนเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์ที่มีสีสันการทดสอบสองครั้งที่ใช้การทดสอบนี้คือการทดสอบ Lowry และการทดสอบกรด bicinchoninic

ด้วยการทดสอบ Lowry, น้ำยา folin-ciocalteu ถูกเพิ่มเข้าไปในการทดสอบ Biuretน้ำยา folin-ciocalteu ออกซิไดซ์อะโรมาติกตกค้างโดยเฉพาะอย่างยิ่งทริปโตเฟนและช่วยให้คอมเพล็กซ์ดูดซับได้อย่างรุนแรงที่ 750 นาโนเมตรในทางกลับกันการทดสอบกรด bicinchoninic เกี่ยวข้องกับการเพิ่มกรด bicinchoninic ลงในการทดสอบ Biuretหลังจากการฟักตัวสั้น ๆ ที่ประมาณ 104 deg;Fahrenheit (40 deg; Celsius), สองเทียบเท่าของกรดและพันธะเปปไทด์ของโปรตีนคีเลตหนึ่งทองแดง (I) ไอออนผลที่ได้คือคอมเพล็กซ์ที่ดูดซับอย่างมากที่ 562 นาโนเมตร

เมื่อเลือกวิธีการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนมันเป็นสิ่งสำคัญสำหรับหนึ่งในการพิจารณากลุ่มการทำงานทางเคมีที่แตกต่างกันที่มีอยู่ในสารละลายการปรากฏตัวของโซ่ด้านกรดอะมิโนบางชนิดพันธะซัลไฟด์และปัจจัยร่วมสามารถทำให้การกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนไม่ถูกต้องอย่างดุเดือดมันมักจะจำเป็นสำหรับการพิจารณาไม่เพียง แต่โปรตีนเท่านั้น แต่ยังรวมถึงรีเอเจนต์และบัฟเฟอร์อื่น ๆ เช่นการลดสารและผงซักฟอกวิธีการในอุดมคติจะเข้ากันได้ทางเคมีเช่นเดียวกับความน่าเชื่อถือราคาถูกและง่ายต่อการตั้งค่า