Apa saja metode penentuan konsentrasi protein yang berbeda?

Ada ratusan metode penentuan konsentrasi protein yang berbeda.Keragaman luar biasa dalam jenis solusi protein yang dianalisis oleh ahli biokimia adalah mengapa tidak ada metode universal tunggal yang berfungsi untuk setiap jenis solusi protein.Tes protein yang paling umum adalah uji Bradford, uji Lowry dan uji asam bicinchoninic.Namun demikian, berbagai variasi telah dikembangkan sesuai kebutuhan untuk mengatasi ketidakcocokan kimia potensial antara larutan protein dan reagen yang digunakan dalam pengujian.

Secara umum, ada dua kategori utama pengujian untuk penentuan konsentrasi protein.Dalam kelompok metode pertama, pewarna warna -warni atau fluoresen ditambahkan ke larutan protein, dan berikatan khusus dengan protein.Pewarna terikat memiliki panjang gelombang penyerapan yang unik yang sebanding dengan jumlah protein.Dengan menggunakan spektrometer, menjadi mungkin untuk memperkirakan konsentrasi protein.

Kelompok tes kedua melibatkan penambahan ion tembaga (II) ke solusi protein, di mana ion -ion ini direduksi menjadi ion tembaga (i).Ion yang dikurangi ini kemudian dapat membentuk kompleks warna -warni dengan mengikat protein.Dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang uniknya, konsentrasi protein juga dapat disimpulkan.

Salah satu metode penentuan konsentrasi protein yang paling populer adalah uji Bradford.Dalam pengujian ini, pewarna merah yang disebut Coomassie Brilliant Blue ditambahkan ke larutan protein dalam kondisi asam.Karena pewarna ini berikatan dengan protein, ia membentuk kompleks biru permanen dengan absorbansi karakteristik pada 595 nanometer.

Meskipun fleksibilitas umum dari uji Bradford, tidak sesuai dengan beberapa solusi protein.Secara khusus, uji Bradford terganggu oleh adanya natrium dodecyl sulfate (SDS), deterjen yang biasanya digunakan untuk memurnikan protein dan memecah sel dengan lisis.Deterjen ini mengganggu pengikatan pewarna dengan protein, yang menghasilkan pembacaan penyerapan yang tidak dapat diandalkan dan tidak akurat.Jenis metode lain, kemudian, harus digunakan ketika SDS hadir.

Serangkaian uji protein lain telah dikembangkan, dan semuanya melibatkan variasi uji biuret.Dalam reaksi ini, protein dikombinasikan dengan basa berair dan ion tembaga (II).Ion -ion ini dikurangi dan kemudian diatur oleh protein untuk membentuk kompleks warna -warni.Dua tes yang menggunakan tes ini adalah uji Lowry dan uji asam bicinchoninic.

Dengan uji Lowry, reagen folin-ciocalteu ditambahkan ke uji biuret.Reagen folin-ciocalteu mengoksidasi residu aromatik, terutama triptofan, dan membantu kompleks menyerap dengan kuat pada 750 nanometer.Uji asam bicinchoninic, di sisi lain, melibatkan penambahan asam bicinchoninic ke uji biuret.Setelah inkubasi singkat sekitar 104 deg;Fahrenheit (40 deg; Celcius), dua ekuivalen asam dan ikatan peptida protein chelate satu ion tembaga (I) tunggal.Hasilnya adalah kompleks yang sangat menyerap pada 562 nanometer.

Ketika memilih metode untuk penentuan konsentrasi protein, penting bagi seseorang untuk mempertimbangkan berbagai kelompok fungsional kimia yang ada dalam larutan.Kehadiran rantai samping asam amino tertentu, ikatan disulfida dan kofaktor dapat membuat penentuan konsentrasi protein sangat tidak akurat.Seringkali perlu bagi seseorang untuk mempertimbangkan tidak hanya protein tetapi juga reagen dan buffer lain, seperti pengurangan agen dan deterjen.Metode yang ideal akan kompatibel secara kimiawi dan juga dapat diandalkan, murah dan mudah diatur.