Melyek a fehérjekoncentráció meghatározásának különböző módszerei?

A fehérjekoncentráció meghatározásának több száz különböző módszere létezik.A biokémikusok által elemzett fehérjeoldatok típusainak hihetetlen sokfélesége az, hogy nincs olyan univerzális módszer, amely minden típusú fehérje oldat esetén működik.A leggyakoribb fehérje -vizsgálat a Bradford -vizsgálat, a Lowry -vizsgálat és a bicinchonininsav vizsgálat.Ennek ellenére számtalan variációt fejlesztettek ki, amennyire szükség van a fehérje oldat és a vizsgálatban alkalmazott reagensek közötti lehetséges kémiai összeférhetetlenségek megkeresésére.A módszerek első csoportjában színes vagy fluoreszcens festéket adunk egy fehérje oldathoz, és kifejezetten a fehérjéhez kötődik.A kötött festéknek egyedi abszorpciós hullámhossza van, amely arányos a fehérje mennyiségével.Spektrométer használatával lehetővé válik a fehérje koncentrációjának becslése.

A vizsgálatok második csoportja réz (II) ionok hozzáadását foglalja magában a fehérje oldatához, ahol ezeket az ionokat réz (I) ionokra redukálják.Ezek a redukált ionok ezután színes komplexeket képezhetnek a fehérjékhez való kötéssel.Ha megmérik az abszorpciókat egyedi hullámhosszukon, a fehérjekoncentrációk szintén következtethetnek.Ebben a vizsgálatban savas körülmények között a Coomassie Brilliant Blue nevű vörös festéket adják a fehérje oldathoz.Mivel ez a festék a fehérjéhez kötődik, állandó kék komplexet képez, jellemző abszorbanciával, 595 nanométernél.Különösen a Bradford -vizsgálatot megszakítja a nátrium -dodecil -szulfát (SDS) jelenléte, amely egy mosószer, amelyet általában a fehérjék tisztítására és a sejtek lízissel történő lebontására használnak.Ez a mosószer zavarja a festék fehérjékhez való kötődését, ami megbízhatatlan és pontatlan abszorpciós leolvasást eredményez.Más típusú módszereket kell használni, amikor SDS van jelen.

Egy újabb fehérje -vizsgálati sorozatot fejlesztettek ki, és mindegyik magában foglalja a biuret -teszt variációját.Ebben a reakcióban a fehérjét vizes bázissal és réz (II) ionokkal kombinálják.Ezeket az ionokat csökkentik, majd a fehérje kelátosítja, hogy színes komplexeket képezzenek.Két vizsgálat, amely ezt a tesztet használja, a Lowry-vizsgálat és a bicinchonininsav-vizsgálat.A folin-ciocalteu reagens oxidálja az aromás maradékokat, különösen a triptofánt, és segít a komplexnek erősen felszívódni 750 nanométernél.A bicinchoninsav -vizsgálat viszont magában foglalja a bicinchoninsav hozzáadását a biuret -teszthez.Egy rövid, körülbelül 104 -es és fokos inkubálás után;Fahrenheit (40 fok; Celsius), két sav -ekvivalens és a protein -kelát peptidkötései egyetlen réz (i) ion.Az eredmény egy olyan komplex, amely erősen felszívódik az 562 nanométernél.Bizonyos aminosav -oldalláncok, diszulfidkötések és kofaktorok jelenléte vadul pontatlanná teheti a fehérjekoncentráció meghatározását.Gyakran szükség van arra, hogy ne csak a fehérjéket, hanem más reagenseket és puffereket is figyelembe vesszük, például a redukáló szereket és a mosószereket.Az ideális módszer kémiailag kompatibilis, valamint megbízható, olcsó és egyszerű beállítható.