Πώς προσδιορίζεται το επίπεδο φωσφορυλίωσης;

Το επίπεδο φωσφορυλίωσης των οργανικών μορίων ή ουσιών προσδιορίζεται με δύο μεθόδους: φασματομετρία Western και φασματομετρία μάζας.Η φωσφορυλίωση αναφέρεται συχνότερα στην προσκόλληση ενός φωσφορικού άλατος σε πρωτεΐνη.Όταν τα φωσφορικά άλατα συνδέονται με τα protiens, οι φυσικές διεργασίες και οι λειτουργίες των πρωτεϊνικών ενζύμων εντός του ανθρώπινου σώματος διαταράσσονται.Ο προσδιορισμός του επιπέδου φωσφορυλίωσης είναι ζωτικής σημασίας για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος ασθενειών, από τον καρκίνο στον διαβήτη.

Η κηλίδωση Western είναι μια δημοφιλής μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του επιπέδου φωσφορυλίωσης ενός συγκεκριμένου συνόλου πρωτεϊνών.Τα αντισώματα όπως τα αντι-φωσφο-τυροσίνη μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται συνήθως επειδή συνδέονται εύκολα με υπολείμματα τυροσίνης πρωτεΐνης, τα οποία επηρεάζονται από φωσφορυλίωση.Σε κηλίδωση Western, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται πρώτα από το μέγεθος χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ηλεκτρικού φορτίου γνωστή ως ηλεκτροφόρηση πηκτής.

Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνη που έχει καλυφθεί με ειδικά αντισώματα που συνδέονται με φωσφορικά σε πρωτεΐνες.Μόλις μεταφερθούν οι πρωτεΐνες, τα αντισώματα θα κολλήσουν σε οποιεσδήποτε πρωτεΐνες με προσαρτημένο φωσφορικό.Το επίπεδο φωσφορυλίωσης μπορεί στη συνέχεια να προσδιοριστεί από μια ακτινογραφία της μεμβράνης.Οποιεσδήποτε προσβεβλημένες πρωτεΐνες θα εκπέμπουν ένα φως του φωτός, καθιστώντας ευκολότερο για τον ερευνητή να μετρήσει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης.

Η φασματομετρία μάζας είναι ένας άλλος τρόπος μέτρησης του επιπέδου φωσφορυλίωσης μιας ουσίας.Αυτή η διαδικασία μετατρέπει τα μόρια πρωτεΐνης σε ιόντα, γεγονός που τους καθιστά ευκολότερο να παρακολουθείται και να μέτρησε.Το δείγμα ιονίζεται από μια πηγή ιόντων υψηλής ισχύος που πλημμυρίζει το δείγμα με ηλεκτρόνια.Αυτή η ενέργεια μετατρέπει το δείγμα σε κατιόντα, θετικά φορτισμένα ιόντα.

Ο αναλυτής μάζας του φασματόμετρου μάζας διαχωρίζει τα ιόντα με τη μάζα και την ένταση του φορτίου.Αυτό επιτρέπει στον ερευνητή να ανακαλύψει τον λόγο μάζας προς φόρτιση, η οποία είναι κρίσιμη για την ανακάλυψη του επιπέδου φωσφορυλίωσης του δείγματος.Τέλος, ο ανιχνευτής μετρά τα ιόντα έτσι ώστε τα δεδομένα να μπορούν να εμφανίζονται σε μορφή γραφήματος.Το διάγραμμα δείχνει τον λόγο μάζας προς φόρτιση των ιόντων στον άξονα x και τη σχετική ένταση των ιόντων στον άξονα y.

Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης μπορούν επίσης να μετρηθούν κατά τη διάρκεια της φωσφορυλίωσης του υποστρώματος.Η φωσφορυλίωση του υποστρώματος είναι μια διαδικασία που δημιουργεί τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ), ένα μόριο που είναι κρίσιμο για τη μεταφορά ενέργειας μεταξύ των κυττάρων, κατά τη διάρκεια της γλυκόλυσης.Αυτή η διαδικασία εμφανίζεται τόσο σε ζωικά κύτταρα όσο και σε φυτικά κύτταρα.

Σε φυτικά κύτταρα, τα μόρια ΑΤΡ δημιουργούνται με τη χρήση ενέργειας από τον ήλιο.Αυτή η ενεργειακή φωσφορυλίωση στους χλωροπλάστες του φυτού, τη θέση της φωτοσύνθεσης φυτών.Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης συσχετίζεται με την ποσότητα φωσφορικών που απαιτείται για τη δημιουργία πρόσθετων μορίων ΑΤΡ.