Bagaimana tingkat fosforilasi ditentukan?

Tingkat fosforilasi molekul atau zat organik ditentukan oleh dua metode: western blotting dan spektrometri massa.Fosforilasi paling sering mengacu pada perlekatan fosfat dengan protein.Ketika fosfat melekat pada protiens, proses alami dan fungsi enzim protein dalam tubuh manusia terganggu.Menentukan tingkat fosforilasi sangat penting untuk mengobati berbagai penyakit, dari kanker hingga diabetes.

Western blotting adalah metode populer yang digunakan untuk menentukan tingkat fosforilasi dari serangkaian protein tertentu.Antibodi seperti antibodi monoklonal anti-fosfo-tirosin biasanya digunakan karena mudah mengikat protein residu tirosin, yang dipengaruhi oleh fosforilasi.Pada western blotting, protein pertama kali dipisahkan oleh ukuran menggunakan metode muatan listrik yang dikenal sebagai elektroforesis gel.

Protein kemudian dipindahkan ke membran yang telah ditutupi dengan antibodi khusus yang berikatan dengan fosfat pada protein.Setelah protein ditransfer, antibodi akan menempel pada protein apa pun dengan fosfat yang melekat.Tingkat fosforilasi kemudian dapat ditentukan oleh sinar-X membran.Protein yang terkena dampak akan mengeluarkan kilatan cahaya, membuatnya lebih mudah bagi peneliti untuk mengukur tingkat fosforilasi.

Spektrometri massa adalah cara lain untuk mengukur tingkat fosforilasi suatu zat.Proses ini mengubah molekul protein menjadi ion, yang membuatnya lebih mudah untuk dilacak dan diukur.Sampel terionisasi oleh sumber ion bertenaga tinggi yang membanjiri sampel dengan elektron.Tindakan ini mengubah sampel menjadi kation, ion yang bermuatan positif.

Penganalisa massa spektrometer massa memisahkan ion dengan massa dan intensitas muatannya.Hal ini memungkinkan peneliti untuk menemukan rasio massa-ke-biaya, yang sangat penting dalam menemukan tingkat fosforilasi sampel.Akhirnya, detektor mengukur ion secara berurutan sehingga data dapat ditampilkan dalam bentuk bagan.Bagan menunjukkan rasio massa-ke-biaya ion pada sumbu x, dan intensitas relatif ion pada sumbu y.

Tingkat fosforilasi juga dapat diukur selama fosforilasi substrat.Fosforilasi substrat adalah proses yang menciptakan adenosine triphosphate (ATP), molekul yang kritis terhadap transfer energi di antara sel, selama glikolisis.Proses ini terjadi di kedua sel hewan dan sel tanaman.

Dalam sel tanaman, molekul ATP dibuat dengan menggunakan energi dari matahari.Energi ini memacu fosforilasi pada tanaman kloroplas, tempat fotosintesis tanaman.Tingkat fosforilasi berkorelasi dengan jumlah fosfat yang diperlukan untuk membuat molekul ATP tambahan.